好的引物會(huì)讓 PCR 實(shí)驗(yàn)成功一半,，因而，引物設(shè)計(jì)一直都是 PCR 非常重要的環(huán)節(jié)。經(jīng)典之法就是讓 Premier5 攜手 oligo,，共同設(shè)計(jì) PCR 引物。

1,、以小鼠的 IL-17 為例,，進(jìn)入 NCBI 界面,選擇 Nucleotide 后，輸入 IL-17,，點(diǎn)擊 search,。然后選擇人類 IL-17 的 mRNA，在 CDS 選項(xiàng)中,，找到編碼區(qū)所在位置,，在下面的 origin 中，
選定目的序列,。

2,、打開 Primer Premier5 軟件，點(diǎn)擊菜單欄 File|New|DNA Sequence,，在出現(xiàn)的對(duì)話框里黏貼目的序列,，并在 paste 對(duì)話框里選擇 As Is，點(diǎn)擊 OK,。

3,、點(diǎn)擊 Primer，彈出菜單后點(diǎn)擊 search 按鈕,。在彈出的 Search Criteria 中,，選擇 PCR primers，Pairs 參數(shù),，并選擇所需PCR 產(chǎn)物長(zhǎng)度,，點(diǎn)擊 OK。在彈出的 search progress 菜單中,，點(diǎn)擊 OK,。

4、在搜索出的結(jié)果列表里選擇 Rating 值高,，bug 較少的引物#1,，在 Primer Premier 中選擇 S（正義鏈）/A（反義鏈）,，點(diǎn)擊 edit primer，將所得引物改成為 Rating 值為 100,，無(wú) bug 的引物,，即無(wú)發(fā)夾（Hairpin）、無(wú)二聚體（Dimer）,、無(wú)錯(cuò)配（False Priming）和交叉配對(duì)（Cross Dimer）的引物,。點(diǎn)擊 Accept and Quit 命令即可。

5,、點(diǎn)擊菜單欄中 Edit∣Copy∣Sense Primer/Anti-sense Primer,，即可得到設(shè)計(jì)的引物。

6,、接下來(lái),，就要用 Oligo 軟件驗(yàn)證評(píng)估 Premier5 軟件所設(shè)計(jì)的引物，單擊菜單欄里 File∣New Sequence 可打開以下窗口,，并將設(shè)計(jì)好的上游引物黏貼在空白框里,。

7、點(diǎn)擊菜單欄里 Accept/Discard 中的 Accept,，則會(huì)出現(xiàn) Tm,、△G 和 Frq 三個(gè)窗口, △G 值反應(yīng)了序列與模板的結(jié)合強(qiáng)度，最好引物的△G 值在 5’端和中間值比較高,，而在 3’端相對(duì)較低,。

8、點(diǎn)擊菜單欄里的 Select 中的 Upper Primer 將當(dāng)前引物設(shè)置為上游引物,。同時(shí)點(diǎn)擊菜單欄里的 Edit 中的“Lower Primer"命令,，在 Edit Lower 窗口中輸入下游引物的序列。點(diǎn)擊 Accept and Quit 命令即可,。

9,、最后，在菜單欄中 Analyze 完成引物△G 值,、Tm 值、引物二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)的分析后,，可將引物序列送至公司進(jìn)行合成即可。

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