一,、試劑配制

1. LB液體培養(yǎng)基,。

2. 100 mg/ml氨芐西林儲(chǔ)存液：稱(chēng)取25g的氨芐西林粉末，加去離子水至250ml,，全部溶解后過(guò)濾,、分裝，20℃保存,。

3. 溶液Ⅰ：50 mmol/L葡萄糖溶液,，25 mmoi/L Tris-鹽酸（pH 8.0），10 mmol/L EDTA（pH 8 0）,。1 mol/L Tris-鹽酸（pH 8.0）12.5ml,，0 5 mol/L EDTA（pH8.0）10ml，葡萄糖4.730g,；加去離子水至500ml,，高壓滅菌，貯存于4℃,。

4. 溶液Ⅱ：0.2moI/L 氫氧化鈉溶液,，1％ SDS（10 N 氫氧化鈉20 μl，10％SDS 100μl,，加去離子水至1ml）,，使用前臨時(shí)配制。

5. 溶液Ⅲ（pH 4.8）：5 mol/L 醋酸鉀300ml,，冰醋酸57.5ml,，加去離子水至500ml，4℃保存,。

6. 苯酚：氯仿（1：1,，V／V）（酚和氯仿均有很強(qiáng)的腐蝕性操作時(shí)應(yīng)戴手套！）,。

7. 無(wú)水乙醇,。

8. 70％乙醇。

9. RNase A（20 mg/ml）溶液：100 mg RNA酶干粉加5ml超純水溶解,，然后在沸水煮

15min,，分裝，20℃保存,。

10. TE緩沖液：10 mmol/L Tris-鹽酸（pH8.0）,，1 mmol/L EDTA（pH8.O）,。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1. 挑取LB固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的單菌落,，接種于2.0ml LB（含Amp 100 μg/ml）液體培養(yǎng)

基中,。37℃、250 r/min振蕩培養(yǎng)過(guò)夜（約12——14h）,。

2. 取1.5ml細(xì)菌培養(yǎng)液倒入離心管中,，4℃、6000轉(zhuǎn)離心30s,，棄上清,，將離心管倒置于紙巾上，去除殘留液體,。

3. 菌體沉淀重懸于100μl用冰預(yù)冷的溶液Ⅰ中,，劇烈振蕩，使菌體分散混勻,，室溫下放置5 min,。

4. 加入200μl新配制的溶液Ⅱ，蓋緊管口,，快速溫和顛倒離心管5——10次,，以混勻內(nèi)容

物，冰浴5min,。

5. 加入150μl預(yù)冷的溶液Ⅲ,，蓋緊管口，溫和顛倒5——10次混勻,，冰浴3——5min,，4℃、6000轉(zhuǎn)離心5min,。轉(zhuǎn)移上清到一個(gè)新的1.5ml Ep管中,。

6. 加入等體積的酚一氯仿抽提劑，振蕩混勻,，4℃,、6000轉(zhuǎn)，離心2 rain,。

7. 小心移出上清于1.5ml Ep管中,；加入2倍體積用冰預(yù)冷的無(wú)水乙醇于室溫沉淀雙鏈

DNA，混勻,，室溫放置2--5rain,，4℃、6000轉(zhuǎn)離心5min。

8. 棄上清,，將離心管倒置于紙巾上使所有液體流出,，加入1ml 70％乙醇，蓋緊離心管顛倒數(shù)次,，4℃,、6000轉(zhuǎn)，離心2min,。

9. 去除所有的乙醇溶液,，將管倒置于紙巾上使液體流盡，室溫干燥5——10min,，直到乙醇都揮發(fā)干凈。

10.將質(zhì)粒DNA沉淀溶于50 μl TE緩沖液（含20 μg/ml RNaseA）中,，溫和振蕩數(shù)秒,，-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

2. 加入SDS后則要注意不能過(guò)分用力振蕩，溫和混勻,，但又必須讓它反應(yīng)充分,。

3. 加入溶液Ⅱ混勻之后，一定要在冰上放置,，不要搖動(dòng),，對(duì)于溶液Ⅲ同樣處理。