一、試劑配制

1. LB液體培養(yǎng)基,。

2. 100 mg/ml氨芐西林儲存液：稱取25g的氨芐西林粉末,，加去離子水至250ml,，全部溶解后過濾、分裝,，20℃保存,。

3. 溶液Ⅰ：50 mmol/L葡萄糖溶液，25 mmoi/L Tris-鹽酸（pH 8.0）,，10 mmol/L EDTA（pH 8 0）,。1 mol/L Tris-鹽酸（pH 8.0）12.5ml，0 5 mol/L EDTA（pH8.0）10ml,，葡萄糖4.730g,；加去離子水至500ml，高壓滅菌,，貯存于4℃,。

4. 溶液Ⅱ：0.2moI/L 氫氧化鈉溶液，1％ SDS（10 N 氫氧化鈉20 μl,，10％SDS 100μl,，加去離子水至1ml），使用前臨時配制,。

5. 溶液Ⅲ（pH 4.8）：5 mol/L 醋酸鉀300ml,，冰醋酸57.5ml，加去離子水至500ml,，4℃保存,。

6. 苯酚：氯仿（1：1，V／V）（酚和氯仿均有很強的腐蝕性操作時應戴手套?。?。

7. 無水乙醇。

8. 70％乙醇,。

9. RNase A（20 mg/ml）溶液：100 mg RNA酶干粉加5ml超純水溶解,，然后在沸水煮

15min，分裝,，20℃保存,。

10. TE緩沖液：10 mmol/L Tris-鹽酸（pH8.0），1 mmol/L EDTA（pH8.O）,。

二,、實驗方法

1. 挑取LB固體培養(yǎng)基上生長的單菌落，接種于2.0ml LB（含Amp 100 μg/ml）液體培養(yǎng)

基中,。37℃,、250 r/min振蕩培養(yǎng)過夜（約12——14h）。

2. 取1.5ml細菌培養(yǎng)液倒入離心管中,，4℃,、6000轉(zhuǎn)離心30s,，棄上清，將離心管倒置于紙巾上,，去除殘留液體,。

3. 菌體沉淀重懸于100μl用冰預冷的溶液Ⅰ中，劇烈振蕩,，使菌體分散混勻,，室溫下放置5 min。

4. 加入200μl新配制的溶液Ⅱ,，蓋緊管口，快速溫和顛倒離心管5——10次,，以混勻內(nèi)容

物,，冰浴5min。

5. 加入150μl預冷的溶液Ⅲ,，蓋緊管口,，溫和顛倒5——10次混勻，冰浴3——5min,，4℃,、6000轉(zhuǎn)離心5min。轉(zhuǎn)移上清到一個新的1.5ml Ep管中,。

6. 加入等體積的酚一氯仿抽提劑,，振蕩混勻，4℃,、6000轉(zhuǎn),，離心2 rain。

7. 小心移出上清于1.5ml Ep管中,；加入2倍體積用冰預冷的無水乙醇于室溫沉淀雙鏈

DNA,，混勻，室溫放置2--5rain,，4℃,、6000轉(zhuǎn)離心5min。

8. 棄上清,，將離心管倒置于紙巾上使所有液體流出,，加入1ml 70％乙醇，蓋緊離心管顛倒數(shù)次,，4℃,、6000轉(zhuǎn)，離心2min,。

9. 去除所有的乙醇溶液,，將管倒置于紙巾上使液體流盡,，室溫干燥5——10min，直到乙醇都揮發(fā)干凈,。

10.將質(zhì)粒DNA沉淀溶于50 μl TE緩沖液（含20 μg/ml RNaseA）中,，溫和振蕩數(shù)秒，-20℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

2. 加入SDS后則要注意不能過分用力振蕩,，溫和混勻,，但又必須讓它反應充分。

3. 加入溶液Ⅱ混勻之后,，一定要在冰上放置,，不要搖動，對于溶液Ⅲ同樣處理,。