內(nèi)皮細(xì)胞的分離

1. 用鋁箔覆蓋軟木板,。

2. 將棉紙鋪在鋁箔上面，然后用 70 % 乙醇浸泡,。

3. 擠出臍帶中的血液,。

4. 切除臍帶一端 2 cm 或 2 cm 以上，包括動(dòng)脈夾痕跡處,。

5. 將 Luer 接合管外套插入靜脈,。

6. 用針將臍帶釘在軟木板上，但注意勿穿經(jīng)血管腔,。

7. 用手術(shù)刀和手術(shù)鑷剝出一段靜脈,，長(zhǎng)約 2 cm。

8. 縫線固定接合管,，緊緊打結(jié)兩次,。

9. 夾閉臍帶另一端，將 20 ml 注射器接在接合管上,，再將 25 ml D-PBSA （放在冰上）注入臍帶,。靠 D-PBSA 的壓力將靜脈擴(kuò)張,。檢査臍帶是否有小孔,。如有小孔，用鱷魚夾夾持臍帶,，使小孔閉合,，但不要夾閉靜脈。

10. 將 D-PBSA 自臍帶排人廢液瓶,。

11. 切除臍帶另一端,，插入接合管，如步驟 8 縫線固定,。

12. 用另一只注射器將 25 ml 膠原蛋白酶液（膠原蛋內(nèi)酶 H：是從溶組織梭狀芽孢桿菌提純的（1074059,，Roche）。0.5 mg/ml,， 用 M199 配制 25 ml）注入臍帶,，直至臍帶膨脹。

13. 用乙醇噴過的塑料薄膜將臍帶包裹,，在 37°C 條件下放置 8 min,。

14. 將膠原蛋白酶液擠出臍帶,，同時(shí)回抽注射器。

15. 拔出注射器,，將膠原蛋白酶液注入含有 5 ml NBS（冷的新生小牛血清,，5 ml） 的試管。

16. 在臍帶另一端換注射器,，將 25 ml D-PBSA 注入臍帶,。

17. 擠壓或拍打整段臍帶一會(huì)兒，然后用此端的注射器抽取 D-PBSA,。

18. 將抽取的 D-PBSA 注入在步驟 15 使用的試管,。

19. 在 4°C  條件下離心（210 g，10 min）,。

20. 用 5 ml HUVFC 生長(zhǎng)培養(yǎng)液混懸細(xì)胞,。

21. 吸去培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)多余的明膠溶液，接種細(xì)胞,。

22. 第 2 天從培養(yǎng)瓶吸去培養(yǎng)液,。

23. 用 D-PBSA 洗兩次，然后加入 HUVEC 生長(zhǎng)培養(yǎng)液（M 199 培養(yǎng)液,，添加 Hank 鹽,、2 mmol/L 谷氨酰胺、25 mmol/L HEPES,、20% FBS,、150 U/ml 青霉素和鏈霉素混合液以及從牛腦提純的內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)添加劑（endothelial cell growth supplement,，ECGS）,。使用 Roche 公司生產(chǎn)的 EGGS （1033484，75 mg）時(shí),，25 μg/ml,，并用 5 μg/ml 肝素，也可使用 Sigma 公司的產(chǎn)品（E2759,，15 mg）,，30 μg/ml，并用 10 μg/ml 肝素）,。

維持培養(yǎng)

24. 吸去一半培養(yǎng)液,，加入新鮮培養(yǎng)液，每周 3 次,。

25. 大約每周傳代一次,。將胰蛋白酶和 EDTA 混合液加入培養(yǎng)瓶，收集細(xì)胞,，然后按 1 : 2 傳代,。

26. 不要使用超過 6 代的細(xì)胞,。