直接從生物體內(nèi)獲取組織細胞進行的首-次培養(yǎng)稱為原代細胞培養(yǎng),。原代培養(yǎng)是建立各種細胞系的第一步，是從事培養(yǎng)工作的人員應(yīng)熟悉和掌握的最基本的技術(shù),。根據(jù)培養(yǎng)方法不同分為組織塊培養(yǎng)法和單層細胞培養(yǎng)法,。

材料與儀器

小鼠
DMEM DMEM 胰酶 PBS
飯盒紗布小剪子小鑷子大鑷子大燒杯平皿研磨玻片濾網(wǎng) 離心管 6 孔培養(yǎng)板吸管移液管手套微量加樣器

步驟

一、實驗步驟

1. 將小鼠斷頸致死,，置 75%酒精泡2-3 秒鐘,，取肝臟，置于盛有 PBS 的平皿中,。

2. 剔除脂肪,、結(jié)締組織,、血液等雜物，轉(zhuǎn)移到另一個盛有 PBS 液的平皿中,。

3. 用手術(shù)剪將臟器剪成小塊(大小約 1mm2),，玻片研磨，轉(zhuǎn)到離心管,，離心(1000 rpm,，5 min)。

4. 視組織或細胞量加額加入5-6 倍(3-5 ml)胰酶,，37℃中消化 20 分鐘,，每隔 5 分鐘振蕩一次，或用吸管吹打一次,，使細胞分離,。

5. 加入3-5 ml 含血清的培養(yǎng)液以中止胰酶消化作用。

6. 用100 目孔徑濾網(wǎng)濾過,，除去未消化的大組織塊,。

7. 再次離心5 min，棄上清液,。

8. 加入無血清培養(yǎng)液5 ml,，沖散細胞，再離心一次,，棄上清液,。

9. 加入含血清的培養(yǎng)液 1-2 ml (視細胞量)，血球計數(shù)板計數(shù),。

10. 將細胞調(diào)整到5x105/ml 左右,，轉(zhuǎn)移至6 孔培養(yǎng)板中，37℃下培養(yǎng),。

注意事項

1. 自取材開始,，保持所有組織細胞處于無菌條件。細胞計數(shù)可在有菌環(huán)境中進行,。

2. 在超凈臺中,，組織細胞、培養(yǎng)液等不能暴露過久,，以免溶液蒸發(fā),。

3. 凡在超凈臺外操作的步驟，各器皿需用蓋子或橡皮塞蓋住,，以防止細菌落入,。

4. 操作前要洗手，進入超凈工作臺后要用75％酒精或0.2％新潔爾滅擦拭手。試劑瓶口也要擦拭,。

5. 點燃酒精燈,，操作在火焰附近進行，耐熱物品要經(jīng)常在火焰上燒灼,。金屬器械燒灼時間不能太長,，以免退火，且冷卻后才能夾取組織,。吸取過營養(yǎng)液的用具不能再燒灼,，以免燒焦形成碳膜。

6. 操作動作要準確敏捷,，但又不能太快,，以防空氣流動，增加污染機會,。

7. 不能用手觸及消毒器皿的工作部分，工作臺面上的用品擺放要布局合理,。

8. 瓶子開口后要盡量保持45°斜位,。

9. 吸溶液的吸管等不能混用。

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小鼠肝細胞培養(yǎng)實驗

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