原理

收集胚胎,，除去絨毛膜,，用胰蛋白酶分散胚胎細(xì)胞,，然后在胚胎成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層上培養(yǎng)從斑馬魚囊胚和原腸期胚獲得的原代細(xì)胞,。

材料與儀器

步驟

鱒魚胚胎提取物：

(a)收集胚胎（受精后 28 天的 Shasta Rainbow 或其他鱒魚種系,，在 10°C 條件下飼養(yǎng)，或者受精后 3 天的斑馬魚,，在 28°C 條件下飼養(yǎng)）,，在 -80°C 條件下凍存

(b)為了制備提取物，將約 150 g 胚胎融化后,，采用 Tissuemizer 勻漿器（Tekmar ) 用 10 ml LDF 在冰上勻漿 2 min

(c)將勻漿通過數(shù)層紗布過濾后去除絨毛膜,，然后在 4°C 條件下離心（20000 g，30 min )

(d)離心后收集上清液,，留下表面的亮橘色脂層

(e)將上清液移入 1 只新離心管,，按操作步驟（c ) 離心

(f)收集上清液，留下剩余的脂質(zhì),，然后在 4°C 條件下超速離心（100000 g,，60 min )

(g)超速離心后收集上清液，留下脂層,。用 LDF (1 : 10 ) 稀釋上清液,，然后過濾除菌

(h)提取物過一系列濾器（1.2 μm、0.45 μm和 0.2 μm )過濾

(i)將提取物按 0.5 ml 分裝后,，在 -80°C 條件下凍存

(j)為了用提取物培養(yǎng)細(xì)胞,，測量蛋白質(zhì)濃度（見方案 21.4 )，然后用 LDF 將提取物稀釋至理想的工作濃度

(k)將稀釋的提取物在 4°C 條件下冷藏,，最長 2 個(gè)月

BRL 細(xì)胞條件培養(yǎng)液：

(a)在 37°C 條件下和在 75 cm2 培養(yǎng)瓶中,，用 DMEM/F12/10FB 培養(yǎng)液培養(yǎng) BRL 細(xì)胞（ATCC )

(b)當(dāng)細(xì)胞匯合時(shí)，用添加 2% FBS 的 LDF 置換 FD 培養(yǎng)液,，在 37°C 條件下培養(yǎng)

(c)5 天后吸出 LDF,，過濾，在 -20°C 凍存

(d)向細(xì)胞中加入新鮮的 LDF,，5 天后重復(fù)此過程,。條件化的 LDF 培養(yǎng)液可從同一個(gè)培養(yǎng)瓶中收集 3 次。然后,，將細(xì)胞分開培養(yǎng),，使細(xì)胞再次匯合

1. 在中襄胚或早原腸胚期收集胚胎,，用清潔水浸洗數(shù)次,。

2. 浸洗后將胚胎移入 60 mm 皮氏皿 ( 50~100 個(gè)/皿）。然后,，將皮氏皿放入層流通風(fēng)櫥中,，在無菌條件下放置。

3. 將胚胎放入稀漂白劑中浸泡 2 min,，然后用無菌的 Holtfreter 緩沖液浸洗數(shù)次,。

4. 用 2 ml 鏈酶蛋白酶 E 溶液孵育 10 min,，使胚胎去絨毛膜。然后,，將胚胎在皮氏皿中輕輕攪動(dòng),，使胚胎與部分消化的絨毛膜分離。

5. 將培養(yǎng)皿傾斜,，以便從一側(cè)收集胚胎,，用巴斯德吸管輕輕吸出 1.5 ml 鏈酶蛋白酶溶液。為了防止去絨毛膜的胚胎黏附在皮氏皿上和破裂,，保持皮氏皿傾斜,，以便胚胎懸浮在剩余的鏈酶蛋白酶溶液中。

6. 加入 2 ml Holtfreter 緩沖液,，輕輕攪動(dòng),，以便輕輕浸洗胚胎。

7. 將皮氏皿傾斜,，吸去大部分 Holtfreter 緩沖液,，將胚胎懸浮在約 0.5 ml 緩沖液中。

8. 重復(fù)浸洗步驟兩次以上,。

9. 在最后 1 次浸洗后,，將胚胎懸浮在 0.5 ml Holtfreter 緩沖液中，然后加入 2 ml 胰蛋白酶溶液,。

10. 用胰蛋白酶將胚胎孵育 1 min,，然后通過用吸管輕輕吹打 3~4 次分離細(xì)胞。

11. 將細(xì)胞懸液立即移入無菌的聚丙烯離心管中,，然后加入 200 μl FBS,，以終止胰蛋白酶的消化作用。

12. 通過離心（500 g,， 5 min ) 收集細(xì)胞,，然后用無 FBS 或鱒魚血清的 LDF 原代培養(yǎng)液混懸細(xì)胞。

13. 將細(xì)胞以 1×104 個(gè)/cm2 的細(xì)胞密度種植到含有生長抑制的成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層的多孔培養(yǎng)板或培養(yǎng)瓶中,。

14. 在加入 FBS 或鱒魚血清前讓細(xì)胞附著于飼養(yǎng)層（約 15 min ),。在培養(yǎng)液中使用 10 ng/ml 人重組 LIF，此優(yōu)于 BRL 條件培養(yǎng)液 [Sun et al.,，1995a,，1995b ]。

以上就是本期的內(nèi)容,，更多資訊,，歡迎點(diǎn)擊安培生物網(wǎng)站鏈接了解更多技術(shù)與產(chǎn)品資訊。

安培生物科技有限公司介紹：

安培生物堅(jiān)持為生命科學(xué)研究,、活體動(dòng)物轉(zhuǎn)染,、大規(guī)模生物生產(chǎn),、基因和細(xì)胞治療領(lǐng)域客戶，提供*細(xì)胞體內(nèi)可代謝的核酸轉(zhuǎn)染試劑,；inviCELL™Platelet lysate無動(dòng)物血清產(chǎn)品旨在支持廣泛的細(xì)胞擴(kuò)增和生產(chǎn),，包括培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞和多種免疫細(xì)胞系等，為制藥公司或者生物技術(shù)公司提供無血清細(xì)胞培養(yǎng)規(guī)模生產(chǎn)服務(wù),；提供以植物生物為平臺基因序列全人源化,、*的細(xì)胞培養(yǎng)可分解3D基質(zhì)膠產(chǎn)品；提供內(nèi)毒素≦ 1.0 EU/mL,、對細(xì)胞無毒性影響,、高純度的一型膠原蛋白產(chǎn)品。安培生物專注為生物醫(yī)藥領(lǐng)域提供優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品和技術(shù)服務(wù),，努力發(fā)展為基因治療,、細(xì)胞治療的生物科技企業(yè)。