原理

以CCK-8法為例簡述其原理：CCK-8試劑盒中含水溶性四唑鹽WST-8 (化學(xué)名：2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑單鈉鹽)，WST-8在電子載體1-Methoxy PMS存在的條件下,，活細胞線粒體中的脫氫酶催化WST-8生成高度水溶性的橙黃色甲瓚燃料,，而甲臜染料的生成量與活細胞的數(shù)量成線性關(guān)系。

用途

1,、藥物篩選實驗,；
2、腫瘤藥敏試驗,；
3,、生物活性因子的活性檢測；
4,、細胞增殖測定等,；

材料與儀器

【材料】細胞懸液，化合物溶液,、CCK8試劑,、*培養(yǎng)基、PBS,、0.25%Trypsin-EDTA

【儀器,，耗材】96孔板，二氧化碳培養(yǎng)箱,，檢測波長450-490nm酶標儀

步驟

1,、根據(jù)具體細胞類型確定其在 96 孔板種植密度，以對照組細胞密度至檢測時達到 70%-90%為參照,，每組設(shè)置 3-6 個復(fù)孔,，孔板邊緣空不用,，加入與培養(yǎng)基等體積的無菌 PBS 溶液；

2. 每孔加入培養(yǎng)基體積 1/10的CCK-8 溶液,。若起始的培養(yǎng)體積為 200 微升,，則需加入 20 微升 CCK-8 溶液，其它情況以此類推,。同時以加了相同體積細胞培養(yǎng)液和 CCK-8 溶液但沒有細胞的孔作為空白對照,。若所用藥物會干擾檢測結(jié)果，則選加入等體積細胞培養(yǎng)液,、藥物和CCK-8溶液但無細胞的孔作為空白對照（注意不可產(chǎn)生氣泡）,；

3. 在細胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育 2-4 小時，建議選取2,、3,、4小時后分別用酶標儀檢測，然后選取吸光度范圍比較適宜的一個時間點用于后續(xù)實驗,；

4. 在 450 nm測定吸光度,。如無 450 nm濾光片，可以使用 420-480 nm的濾光片,?？梢允褂么笥?600 nm的波長，例如 650 nm,，作為參考波長進行雙波長測定,。

注意事項

1、本實驗使用96孔板進行檢測,，周圍一圈最容易蒸發(fā),，檢測會因體積不準確而增加誤差故棄用周圍一圈，加入等體積相同量的PBS,、水或培養(yǎng)液,；

2、本試劑盒的檢測依賴于脫氫酶催化的反應(yīng),，因而還原劑(例如一些抗氧化劑)會干擾檢測,，如果待檢測體系中存在較多的還原劑，需設(shè)法去除,。

3,、用酶標儀檢測前需確保每個孔內(nèi)沒有氣泡，否則會干擾測定,；

4,、酚紅和血清對CCK-8法的檢測不會造成干擾，可以通過扣除空白孔中本底的吸光度而消去；

5,、試劑有一定的毒性,，請穿好實驗服并戴一次性手套操作；

6,、試劑要注意避光4oC或-20oC保存,；

常見問題

1. 如果細胞生長較慢，且細胞較小,，可以最大接種1x10^4 cells/well,，但加入化合物后處理時間最長為72 h。

2. 化合物如果難溶于水,，可以在培養(yǎng)基中適當添加DMSO,、DMF以助溶，但最大濃度不宜超過0.5%,，因為DMSO和DMF對細胞也有一定的毒性。如果使用DMSO,、DMF助溶,，需保證其他濃度的化合物DMSO、DMF的濃度也相同,。

3.若吸光度值太低,，怎么辦法？
1）適當增加細胞數(shù)量,；
2）延長加入CCK-8溶液后的孵育時間