小鼠皮下成瘤,、小鼠皮下血管生成實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備程序 

A、細(xì)胞房內(nèi)材料準(zhǔn)備,、試劑制備及步驟 

(1) 材料準(zhǔn)備: 

1. 冰盒,、2. 37 ℃ 水浴槽、3. C 緩沖溶液(10X),、4. 含15-20%血清細(xì)胞培養(yǎng)液 (例如: 含15-20%血清的 DMEM,，DMEM-F12等，不可用 PBS ),、5. A 膠 (2X),、6. 細(xì)胞培養(yǎng)液、7. 23-26G 針頭,、8. 1 mL 針筒,、9. 細(xì)胞。

(2) 試劑制備: 

1,、C 緩沖溶液 (0.5 X) 制備 : 使用 37 ℃ 水浴回溫含15-20%血清的細(xì)胞培養(yǎng)液 (例如: 含15-20%血清 的DMEM 或DMEM-F12 等,，不可用 PBS ) 稀釋 C 緩沖溶液 (10 X) 至 C 緩沖溶液 (0.5 X), 即體積稀釋 20 倍。使用前放置 37 度水浴槽,。(例如:1 mL C 緩沖溶液 (10 X) + 19 ml 含血清 的DMEM; 若未使用完 畢,，可先保存于4 ℃ 冰箱, 保存一周) 

（注1 :若為小鼠皮下血管生成實(shí)驗(yàn)，制備C緩沖溶液 (0.5 X)時(shí)可加入1500 μM Hearin以及60 μg/ml VEGF,。） 

2,、A膠 (1X) 制備 : 將 A膠 (2X) (貨號:B--00002-A) 置于37 ℃ 水浴槽回溫10分鐘，確認(rèn)*溶解,。再 將 37 ℃ 水浴回溫的含15-20%血清的細(xì)胞培養(yǎng)液取 0.5 mL,，加至 37 ℃ 已溶解的 0.5 mL A膠 (2X)， 配置成 1 mL 的 A膠 (1X)。使用前置于37度,，可降低黏度,。 (單次使用，勿重復(fù)冷凍解凍 A膠 (1X) ) 

(3) 步驟: 

1,、取細(xì)胞溶液離心后收集細(xì)胞沉淀,，與C緩沖溶液 (0.5 X) 均勻混合使細(xì)胞濃度為3*106-7 cells/mL。

2,、A膠 (1X) 與步驟 1 含 C緩沖溶液 (0.5 X) 的細(xì)胞系懸浮液,，按照 2:1 比例均勻混合配置，細(xì)胞懸浮液 最終濃度為 106-7 cells/mL,。使用前置于37℃,，可降低黏度。 (C緩沖溶液用于A膠凝膠反應(yīng),，例如0.5ml C 緩沖溶液(0.5 X)含細(xì)胞 加入 1ml A膠 (1X) 混合成1.5ml 的注射液) 

（注2 :若為小鼠皮下血管生成實(shí)驗(yàn),，可將1500 μM Hearin 以及60 μg/ml VEGF加入C緩沖溶液 (0.5 X)，待A膠 (1X) 與含C緩沖溶液 (0.5 X) 的癌細(xì)胞懸浮液,，依2:1 比例均勻混合后,，使Hearin及VEGF最終濃度為：500 μM Hearin以 及20 μg/ml VEGF） 

3、選用 23-26 G 的針頭 (建議選用 24 G) 及 1 mL 針筒,，抽取 步驟2 A膠與 C緩沖溶液的細(xì)胞混合液至所 需注射體積 (例如:0.2-0.6 mL) ,。室溫37℃至20℃操作抽取。 (若抽取時(shí)發(fā)生塞針狀態(tài),，可先把針頭拔掉,， 以針筒進(jìn)行抽取，建議一次抽取配置好所需針筒數(shù)量,，避免步驟2 溶液過度凝膠,，發(fā)生塞針)

4、將抽取好步驟 3 的針筒,，帶入動(dòng)物房, 若短時(shí)間無法施打建議置于冰上,。 

B、動(dòng)物房內(nèi)材料準(zhǔn)備及步驟

(1)材料準(zhǔn)備: 

1. 含 A膠與 C緩沖溶液的細(xì)胞混合液的針筒,、2. 皮膚消毒劑 (例如 : 酒精),、 3. 手套、4. 實(shí)驗(yàn)小鼠,、5. 麻醉小鼠的試劑

(2)步驟: 

1,、室溫下可直接注射。若是置于冰盒上的針筒,，回到室溫后,，待液化再進(jìn)行注射,。含A膠與C緩沖溶液的細(xì) 胞混合液的針筒，以皮下注射方式,，注射實(shí)驗(yàn)所需的體積至實(shí)驗(yàn)鼠 (建議皮下注射量為 0.2 mL,，實(shí)際狀況 依需求而定)。(針筒放冰上注射阻力會上升, 放室溫會液化注射阻力小,。注射時(shí)若因凝膠緣故而阻力變大,， 需緩慢注射避免針頭噴落) 

注1 : 注射體積可依不同實(shí)驗(yàn)?zāi)康淖稣{(diào)整，若為皮下血管生成研究注射體積需至少0.5 mL以上,。 

注2 : 若為血管生成實(shí)驗(yàn),，建議在實(shí)驗(yàn)鼠血管豐富的部位進(jìn)行注射。 

注3 : 此步驟依實(shí)驗(yàn)需求可執(zhí)行或不執(zhí)行,，若需呈現(xiàn)明顯的皮下注射隆起效果,，可調(diào)整2.試劑制備將C緩沖 溶液 (10 X) 稀釋15倍，變成C緩沖溶液 (0.66 X),，再執(zhí)行后續(xù)成膠實(shí)驗(yàn),；提高C濃度，可提高膠體硬度,。

2,、培養(yǎng)一至三周后觀察量測接種的腫瘤尺寸,。 

注 4 : 若為血管生成研究,，應(yīng)注射含 VEGF 及 heparin 的 A 膠，以促進(jìn)血管生成,。約三天后,，可摘取含有 新血管生成的腫瘤組織。