三,、如何消除污染
機(jī)器運(yùn)行完后，取出PCR產(chǎn)物時(shí)不能隨便丟棄,，應(yīng)該用塑料手套或其他打結(jié)包好后丟入垃圾桶,。
（1） 試劑：mixer盡量分裝，不要原瓶多次取用,。
（2） 加樣：原則是DNA最后加,，其他試劑按照體積大小從大往小的加。如果是同種引物和探針有多管的話只是DNA不同,，那么采取的方法是算出總體積后加在一個(gè)管子里面,，混合均勻之后再分裝到各個(gè)管子里去，這樣可以有效地避免誤差及污染,。 另外,，普通實(shí)驗(yàn)室容易污染，且污染程度很高,，與跑電泳還有質(zhì)粒制備提取都在同一個(gè)房間里有比較大的關(guān)系,，最容易造成高濃度污染的就是產(chǎn)物的開蓋和質(zhì)粒的稀釋。 目前,，國(guó)內(nèi)外各個(gè)公司提供的診斷試劑盒大多采用了UNG來防污染,。Uracil-DNA N-glycosylase（UNG）尿嘧啶DNA糖基酶,，來源于大腸桿菌重組克隆表達(dá)。
四,、RNA定量
RNA也最好至少要用電泳,，一方面定量，另一方面可以看看完整性,。至于用分光光度計(jì)比較不同標(biāo)本之間就更不準(zhǔn)了,。 RNA的貯藏，最主要的是溫度,，-20不夠，最好-80,，液氮最保險(xiǎn) mRNA是不能代替蛋白水平的分析的,，因?yàn)檫€有翻譯效率和RNA降解速度的影響。
五,、RT-PCR有兩種做法
條件具備的話可用kit進(jìn)行一步法進(jìn)行,；若條件不太好的話可分兩步進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄再PCR。但后來發(fā)現(xiàn)兩步法的結(jié)果更加理想,，條帶特異性強(qiáng)且無拖尾現(xiàn)象,，我推測(cè)是體系更加單一比較利于PCR的進(jìn)行 一定要做內(nèi)參的，每一次,，我想,。不作內(nèi)參的結(jié)果是不可信的 電泳可以不一起跑，沒有關(guān)系,，計(jì)算的是相對(duì)表達(dá)程度,，半定量和定量RT-PCR做的都是基因相對(duì)表達(dá)量，不是絕對(duì)表達(dá)量,。
六,、mRNA的分離與純化
步驟（4）中將RNA溶液置65 ℃中溫育然后冷卻至室溫再上樣的目的有兩個(gè)，一個(gè)是破壞RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu),，尤其是mRNA Poly(A+)尾處的二級(jí)結(jié)構(gòu),，使Poly(A+)尾充分暴露，從而提高Poly(A+)RNA的回收率,；另一個(gè)目的是能解離mRNA與rRNA的結(jié)合,，否則會(huì)導(dǎo)致rRNA的污染。所以此步驟不能省略,。
七,、下面，我們介紹一個(gè)可以確認(rèn)RNA溶液中有沒有殘留的RNA酶的方法：
保溫試驗(yàn)方法很簡(jiǎn)單的,，按照樣品濃度,，從RNA溶液中吸取兩份1 000 ng的RNA加入至0.5 ml的離心管中,并且用pH7.0的Tris緩沖液補(bǔ)充到10 ul的總體積,，然后密閉管蓋。把其中一份放入70 ℃的恒溫水浴中,保溫1 h,。另一份放置在-20 ℃冰箱中保存1 h,。 時(shí)間到了之后，取出兩份樣本進(jìn)行電泳,。電泳完成后,，比較兩者的電泳條帶。如果兩者的條帶一致或者無明顯差別（當(dāng)然,，它們的條帶也要符合方法2中的條件）,， 則說明RNA溶液中沒有殘留的RNA酶污染，RNA的質(zhì)量很好,。相反的,，如果70 ℃保溫的樣本有明顯的降解，則說明RNA溶液中有RNA酶污染,。
八,、PCR污染與對(duì)策
1. PCR擴(kuò)增產(chǎn)物污染
這是PCR反應(yīng)中最主要常見的污染問題，所以,，擴(kuò)增區(qū)的儀器什么如槍頭等要注意,。 還有一種容易忽視，最可能造成PCR產(chǎn)物污染的形式是氣溶膠污染,；在空氣與液體面摩擦?xí)r就可形成氣溶膠,，在操作時(shí)比較劇烈地?fù)u動(dòng)反應(yīng)管，開蓋時(shí),、吸樣時(shí)及污染進(jìn)樣槍的反復(fù)吸樣都可形成氣溶膠而污染.據(jù)計(jì)算一個(gè)氣溶膠顆?？珊?8000拷貝，因而由其造成的污染是一個(gè)值得特別重視的問題,。
1)標(biāo)本處理區(qū),，包括擴(kuò)增摸板的制備；
2)PCR擴(kuò)增區(qū),，包括反應(yīng)液的配制和PCR擴(kuò)增,；
3)產(chǎn)物分析區(qū)，凝膠電泳分析,，產(chǎn)物拍照及重組克隆的制備,。
各工作區(qū)要有一定的隔離，操作器材專用,，要有一定的方向性,。如：標(biāo)本制備→PCR擴(kuò)增→產(chǎn)物分析→產(chǎn)物處理。 切記：產(chǎn)物分析區(qū)的產(chǎn)物及器材不要拿到其他兩個(gè)工作區(qū)。 使用一次性吸頭,，嚴(yán)禁與PCR產(chǎn)物分析室的吸頭混用,，吸頭不要長(zhǎng)時(shí)間暴露于空氣中，避免氣溶膠的污染,； 操作多份樣品時(shí),，制備反應(yīng)混合液，先將dNTP,、緩沖液,、引物和酶混合好，然后分裝,，這樣即可以減少操作,，避免污染，又可以增加反應(yīng)的精確度,。
2. 反應(yīng)液污染 可采用下列方法之一處理：
1)DNase I法：PCR混合液（未加模板和Taq聚合酶）加入0.5 U DNase I,，室溫反應(yīng)30 min后加熱滅活，然后加入模板和Taq聚合酶進(jìn)行正常PCR擴(kuò)增,。該方法的優(yōu)點(diǎn)是不需要知道污染DNA的序列；
2)尿嘧啶糖苷酶（UNG）法 由于UV照射的去污染作用對(duì)500 bp以下的片段效果不好,，而臨床用于檢測(cè)的PCR擴(kuò)增片段通常為300 bp左右,，因此UNG的預(yù)防作用日益受到重視和肯定。
a,、提取mRNA時(shí)所用的EP管,、玻璃等器皿全部都要用0.1%DEPC水浸泡。然后烘干,，高壓滅菌,，再烘干。
b,、用DEPC水洗過后當(dāng)然不能用雙蒸水洗了,。那你用DEPC處理還有什么意義呢？還要用雙蒸水洗嗎,？
c,、玻璃器皿干烤：180度，8小時(shí)或更長(zhǎng)時(shí)間,；小器皿也可以用少許氯仿處理一下,。另外，鐵制品,、研砵等也可倒上酒精直接燒,。
RNA提取
一、RNA提取前的準(zhǔn)備
1. 研缽的處理
1) 自來水反復(fù)沖洗；
2) 去污劑或者洗滌靈沖洗,；
3) 自來水反復(fù)沖洗,；
4) 蒸餾水浸泡1~2d；
5) 超凈工作臺(tái)內(nèi)用無水乙醇沖洗2~3遍,，晾干,。（在RNA提取前，紫外殺菌10min）
2. 槍頭及EP管的處理
1) 0.1%DEPC水浸泡1~2w,；
2) 用鑷子夾起槍頭一一裝入槍頭盒中,，用鑷子夾起EP管放入飯盒中；
3) 高壓滅菌50min,，45度烘箱烘干,。
二、RNA的提取
Trizol法適用于人類,、動(dòng)物,、植物、微生物的組織或培養(yǎng)細(xì)菌,，樣品量從幾十毫克至幾克,。用Trizol法提取的總RNA*蛋白和DNA污染。 RNA可直接用于Northern斑點(diǎn)分析,，斑點(diǎn)雜交,， Poly(A)+分離，體外翻譯,，RNase封阻分析和分子克隆,。
在收集到生物材料之后，最好能即刻進(jìn)行RNA制備工作,。若需暫時(shí)儲(chǔ)存,，則應(yīng)以液氮將生物材料急速冷凍后，儲(chǔ)存于-80 ℃冷凍柜,。在制備RNA時(shí),，將儲(chǔ)存于冷凍柜的材料取出，立即以加入液氮研磨的方式打破細(xì)胞,，不可以先行解凍,，以避免RNase的作用。
1. 將組織在液N中磨成粉末后,，再以50-100 mg組織加入1 ml Trizol液研磨,，注意樣品總體積不能超過所用Trizol體積的10%；提取細(xì)胞RNA時(shí),，先離心沉淀細(xì)胞,，每5-10×106個(gè)細(xì)胞加1 ml Trizol后,，反復(fù)用槍吹打或劇烈振蕩以裂解細(xì)胞；
2. 將上述組織或細(xì)胞的Trizol裂解液轉(zhuǎn)入EP管中,在室溫15~30 ℃下放置5分鐘,；然后以每1 mlTrizol液加入0.2 ml的比例加入氯仿,，蓋緊離心管，用手劇烈搖蕩離心管15秒,。 在室溫下（15 ℃～30 ℃）放置2～3分鐘后,，12000 g（2 ℃～8 ℃）離心15分鐘；
3. 取上層水相（離心后,，混合物將分離為底層為淺紅的,、中層為酚-氯仿相、上層為無色的水相,。RNA包含在水相中,，水相的體積約相當(dāng)于所加的Trizol試劑量的60%）于一新的離心管，按每1 mlTrizol液加0.5 ml異丙醇的比例加入異丙醇,，室溫（15 ℃～30 ℃）放置10分鐘,，12000 g（2 ℃～8 ℃）離心10分鐘。
4. 棄去上清液（RNA沉淀為一層如凝膠樣透明的小塊附在管底和管壁）,，按每1 ml Trizol液加入至少1 ml的比例加入75%乙醇進(jìn)行洗滌,，渦旋混勻，4 ℃下7500 g離心5分鐘,。
5. 小心棄去上清液,，讓沉淀的RNA在室溫下自然干燥或真空干燥5-10分鐘，注意不要干燥過分,，否則會(huì)降低RNA的溶解度。
6. 加適量Rnase-free water 溶解RNA沉淀（60 ℃ 10 min）,。-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/div>
7. RNA可進(jìn)行mRNA分離,，或貯存于70%乙醇并保存于-70 ℃。
[注意]
1. 整個(gè)操作要帶口罩及一次性手套,，并盡可能在低溫下操作,。另外，提取上清這步一定要小心,，靠近沉淀的部分一定要舍得不要,，要不然會(huì)有蛋白質(zhì)污染，影響比值,。
2. 加氯仿前的勻漿液可在-70 ℃保存一個(gè)月以上,，RNA沉淀在70%乙醇中可在4 ℃保存一周，-20 ℃保存一年,。
在實(shí)驗(yàn)過程中要防止RNA的降解,，保持RNA的完整性。在總RNA提取過程中注意避免mRNA 的斷裂；取2 ug進(jìn)行RNA檢測(cè),，如果存在DNA污染時(shí),，要用DNase I進(jìn)行消化（因?yàn)樵谔幚磉^程中RNA極易降解，建議體系中加入適量RNA酶抑制劑,。
