不同組織樣本的RNA提取適用不同的提取方法,，因?yàn)镽eal-Time PCR對(duì)RNA樣品的質(zhì)量要求較高,，所以，正式實(shí)驗(yàn)前要選擇一款適合自己樣品的提取方法,，在實(shí)驗(yàn)過程中要防止RNA的降解,，保持RNA的完整性。
在總RNA的提取過程中,，注意避免mRNA的斷裂,；取2ug進(jìn)行RNA的甲醛變性膠電泳檢測，如果存在DNA污染時(shí),，要用DNase I進(jìn)行消化（因?yàn)樵谔幚磉^程中RNA極易降解,，建議體系中加入適量RNA酶抑制劑）
三,、RNA瓊脂糖凝膠電泳
1. 1%的瓊脂糖凝膠電泳凝膠的配制：
1） 稱取瓊脂糖0.45 g放入三角瓶中,，向其中加入4.5 ml的10×MOPS緩沖液和39.5 ml的DEPC水，放微波爐里溶化,。
2） 待冷卻到60攝氏度左右時(shí),，加入1 ml甲醛，搖勻（避免產(chǎn)生氣泡）,。倒入凝膠板上凝固30 min,。
2. 取各個(gè)RNA樣品4 μl，加入6×RNA電泳上樣緩沖液2 μl混勻,，加入變性膠加樣孔中,。
3. 120V電壓下電泳25 min,。用凝膠紫外分析儀觀察,，照相保存。
另外還有一種RNA檢測方法：
濃度檢測：取4 μl RNA,，加蒸餾水至1 000 μl,，混勻。測OD260,、OD280
四,、RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA
反轉(zhuǎn)錄程序(以MBI的M-MLV為例)
反轉(zhuǎn)錄引物的選擇與Real-Time PCR引物設(shè)計(jì)的要求
1）隨機(jī)六聚體引物：
當(dāng)特定mRNA由于含有使反轉(zhuǎn)錄酶終止的序列而難以拷貝其全長序列時(shí)，可采用隨機(jī)六聚體引物這一不特異的引物來拷貝全長mRNA。用此種方法時(shí),，體系中所有RNA分子全部充當(dāng)了cDNA第一鏈模板,，PCR引物在擴(kuò)增過程中賦予所需要的特異性。通常用此引物合成的cDNA中96%來源于rRNA,。
2）Oligo(dT)：
是一種僅對(duì)mRNA特異的方法,。因絕大多數(shù)真核細(xì)胞mRNA具有3'端Poly(A+)尾，此引物與其配對(duì),，僅mRNA可被轉(zhuǎn)錄,。由于Poly(A+)RNA只占總RNA的1-4%，故此種引物合成的cDNA比隨機(jī)六聚體作為引物和得到的cDNA在數(shù)量和復(fù)雜性方面均要小,。特別適合檢測多個(gè)基因的表達(dá),，這樣可以節(jié)約反轉(zhuǎn)錄的試劑，cDNA可以多次使用,，可用于檢測稀有基因是否表達(dá),、從極少量細(xì)胞中定量檢測特定mRNA的表達(dá)水平。
3）特異性引物：
最特異的反轉(zhuǎn)錄方法是用含目標(biāo)RNA的互補(bǔ)序列的寡核苷酸作為引物,，若PCR反應(yīng)用二種特異性引物,，第一條鏈的合成可由與mRNA3'端最靠近的配對(duì)引物起始。用此類引物僅產(chǎn)生所需要的cDNA,，導(dǎo)致更為特異的PCR擴(kuò)增,。
做 Real Time PCR時(shí)，用于SYBR Green I/Eva Green 法時(shí)的一對(duì)引物與一般PCR的引物,，在引物設(shè)計(jì)上所要求的參數(shù)是不同的,。引物設(shè)計(jì)的要求：
① Tm=55-65 ℃
② GC=30-80%
③ PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長度：引物的產(chǎn)物大小不要太大，一般在80-300 bp之間都可,。
④ 引物的退火溫度要高,，一般要在 60 ℃以上。
要特別注意避免引物二聚體和非特異性擴(kuò)增的存在,。而且引物設(shè)計(jì)時(shí)應(yīng)該考慮到引物要有不受基因組DNA污染影響的能力,，即引物應(yīng)該跨外顯子，最好是引物能跨外顯子的接頭區(qū),，這樣可以更有效的不受基因組DNA污染的影響,。
至于設(shè)計(jì)軟件，PRIMER3,，PRIMER5,，PRIMER EXPRESS都應(yīng)該可以的。做染料法最關(guān)鍵的就是尋找到合適的引物和做污染的預(yù)防工作,。對(duì)于引物,，你要有從一大堆引物中挑出一兩個(gè)能用的引物的思想準(zhǔn)備---尋找合適的引物非常不易,。
五、cDNA與引物質(zhì)量檢測
取0.2 ml薄壁PCR管,，編號(hào),。向各管中加入含染料2×PCR TaqMix10 ul；加入正反向引物各0.5 ul（引物濃度10 uM） ,，向管中加入混合的cDNA各1 ul,。各管補(bǔ)加水至20 ul。
組份 加量
2×PCRTaqMix 10 ul
10 uMPrimer FW 0.5 ul
10 uMPrimer RV 0.5 ul
Template DNA 1 ul
ddH2O 混勻至20 ul
混勻,，置于TP600PCR儀中,。95 ℃ 5 min；95 ℃15 s,，60 ℃35 s ,，40 cycles；72 ℃ 5 min,；4 ℃ pause,。
取擴(kuò)增產(chǎn)物各8 μl，DL2000 分子量標(biāo)準(zhǔn)5 μl/泳道,。1%瓊脂糖凝膠120V電壓下電泳25 min,。用凝膠紫外分析儀觀察。
選擇特異性好,，擴(kuò)增效率高的引物作為實(shí)時(shí)熒光使用引物,。
六、利用相對(duì)定量的方法分析目的基因表達(dá)量的情況
由于RNA純化后得率不同,、RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA的效率不同等客觀因素,，用于定量分析的初始樣品濃度不同，因此,，在進(jìn)行基因表達(dá)調(diào)控研究中都會(huì)用一些看家基因來標(biāo)準(zhǔn)化,，以校正因樣品初始濃度不同而造成的差異。常用的看家基因有beta-actin,，GAPDH,，18SrRNA等。因此,，在做基因表達(dá)調(diào)控分析時(shí)至少要做兩個(gè)基因,，目的基因和一個(gè)看家基因。
七,、定量 PCR檢測
取0.2 ml薄壁PCR管,，分別編號(hào),。向各管中加入2×qPCR TaqMix12.5 ul,，10 uM各基因正反向引物混合物0.5 ul,，對(duì)應(yīng)的cDNA各1 ul。一管中不加模板用作陰性對(duì)照,。各管補(bǔ)加水至25 ul,。
混勻，置于SLAN熒光定量PCR儀中,。95℃5min預(yù)變性后,，95℃15 s→65℃35 s（熒光檢測），40 cycles,。熒光定量PCR一般把退火和擴(kuò)增設(shè)成一個(gè)溫度,，只在擴(kuò)增出現(xiàn)問題時(shí)才會(huì)考慮設(shè)梯度。
（侯哥論文中的：95 °C 10分鐘→95 °C 15秒→60 °C 1分鐘,；40個(gè)循環(huán),。）
以雙△Ct值法計(jì)算靶基因相對(duì)表達(dá)水平：
GRP78相對(duì)表達(dá)水平=2-△(△CT)
注：△CT =Ct(GRP78)-Ct(GAPDH); △(△CT)= △CT (LLLI)- △CT (contro1)。
如果在熒光背景信號(hào)階段出現(xiàn)很多拐點(diǎn),，可能的原因是體系未混勻或者存在固態(tài)雜質(zhì),；
如果向下探頭后又很快抬頭然后又向下探頭，可能原因是體系中模板量太高,，建議模板稀釋后再用,。
如果引物二聚體存在則陰性對(duì)照會(huì)出現(xiàn)抬頭現(xiàn)象，這在Real-Time PCR中很難避免,；
若是陰性對(duì)照的溶解曲線出現(xiàn)和樣品中同樣的峰,，說明體系配置中存在污染，則實(shí)驗(yàn)結(jié)果不可用,。
在溶解曲線中出現(xiàn)雙峰有三種可能：
① 引物峰,，引物峰通常是兩峰中的前面一個(gè)，消除的辦法是降低體系中的引物量或重新設(shè)計(jì)引物,；
② 在做基因表達(dá)差異時(shí)容易出現(xiàn)DNA被擴(kuò)增峰（只在引物跨內(nèi)含子時(shí)存在）,，出現(xiàn)原因是提取RNA時(shí)存在DNA污染，可以通過電泳驗(yàn)證,，這時(shí)要重新消化RNA樣品中的DNA,；
③ 擴(kuò)增非特異，這時(shí)要重新摸擴(kuò)增條件或重新設(shè)計(jì)并驗(yàn)證引物,。
八,、表達(dá)差異的計(jì)算方法
絕對(duì)定量通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算起始模板的拷貝數(shù)；相對(duì)定量方法則是比較經(jīng)過處理的樣品和未經(jīng)處理的樣品目標(biāo)轉(zhuǎn)錄本或是目標(biāo)轉(zhuǎn)錄本在不同時(shí)相的表達(dá)差異之間的表達(dá)差異,。
2-△△CT方法是實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)中分析基因表達(dá)相對(duì)變化的一種簡便方法,。
在有些情況下，并不需要對(duì)轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行絕對(duì)定量,，只需要給出相對(duì)基因表達(dá)差異即可,。顯然,，我們說X基因在經(jīng)過某種處理后表達(dá)量增加2.5倍比說該基因的表達(dá)從1000 拷貝/細(xì)胞增加到2500拷貝/細(xì)胞更加直觀。
2-△△CT方法的推導(dǎo)（詳見實(shí)時(shí)定量PCR和2-△△CT法分析基因相對(duì)表達(dá)量）
補(bǔ)充：在DNase I 消化樣品RNA 中的DNA后,，需要對(duì)樣品重新進(jìn)行氯仿抽提,，具體實(shí)驗(yàn)流程如下：
消化后總體積100 ul，體積太少,，不利于抽提,，我們往往補(bǔ)加200 ulDEPC水。
1. 向離心管中加入等體積氯仿（約300 ul） ,，劇烈顛倒,，充分混勻至中層出現(xiàn)白色片狀沉淀。4℃14 000 rpm離心8 min,，取上清（約250 ul）,。
2. 加入1/10體積的NaAC（3 M）（約25 ul）和預(yù)冷的等體積異丙醇（約280 ul），-20℃放置20 min,。
3. 4℃14 000 rpm離心15 min,，去上清，注意不要觸到沉淀,。
4. 加入1 ml的75%乙醇,，4℃14 000 rpm離心3 min，去上清,。
5. 瞬時(shí)離心,，用200 ul（或10 ul）的槍頭小心吸去離心管底的殘存液態(tài)（勿吸到管底的沉淀）。
6. 把離心管放置于超凈臺(tái)晾至約5-10 分鐘（勿*干燥,，否則很難溶）,。加入30~50 μl的無RNase的水，靜止1 min 后,，振蕩30sec,，瞬時(shí)離心。
7. 將提取的RNA立即進(jìn)行下游實(shí)驗(yàn),，或放-20 ℃保存,。
