補體介導(dǎo)法

時間：2022/3/11閱讀：1187

原理

帶有特異抗原的靶細胞（如正常細胞,、腫瘤細胞,、病毒感染細胞）與相應(yīng)抗體結(jié)合后，在補體的參與下,，引起靶細胞膜損傷,，導(dǎo)致細胞膜的通透性增加、細胞死亡,。染料（例如：伊紅-Y,、臺盼藍）可通過細胞膜進入細胞內(nèi)使細胞著色，故可用于指示死細胞或瀕死細胞,，而活細胞不著色,。此即補體依賴性細胞毒試驗，利用細胞毒試驗可以檢查細胞膜抗原,，亦可鑒定抗體的特異性,。

本實驗中，Thy-1抗原是小鼠胸腺T細胞特異的表面抗原,，在體外利用抗小鼠Thy-1的單克隆抗體通過補體的協(xié)同作用,，可殺傷95%以上的胸腺細胞,。

材料與儀器

C57BL／6J小鼠
Hank’s液單克隆抗體補體伊紅-Y染液
眼科剪眼科鑷平皿不銹鋼網(wǎng) 試管吸量管尖吸管載玻片蓋玻片顯微鏡

步驟

一,、實驗方法

1. 小鼠胸腺細胞懸液的制備：將4～6周齡小鼠采用頸椎脫臼法處死，取出胸腺放入已加入約4 ml冷Hank’s液的平皿中,，在100目的不銹鋼網(wǎng)上研磨后,，過篩，放入試管,，離心1 000 rpm,，5分鐘，用Hank’s液洗兩次,。將沉淀的細胞重懸于Hank’s液中,，配成1×107/ml細胞懸液。

2. 取試管3支,，標明順序,，依據(jù)下表依次加入1×107/ml胸腺細胞懸液、抗小鼠Thy-1的單克隆抗體(最適稀釋度)及Hank’s液,，放入37℃水浴30分鐘,。

3. 取出后每管加入1%伊紅-Y染液1滴，混勻,，室溫放置2分鐘,。

4. 重新混勻后分別在一張載玻片上滴片,，加蓋玻片鏡檢。先在低倍鏡下觀察,，再用高倍鏡觀察,，比較3管中細胞死活情況。

二,、實驗結(jié)果

死細胞呈紅色,，無光澤且腫脹變大；活細胞不著色,、有光澤且形態(tài)正常,。

高倍鏡下計數(shù)200個細胞并計算其中死細胞的百分數(shù)。計算公式如下：死細胞百分數(shù)= EQ EQ \F(實驗管死細胞數(shù)%-對照管死細胞數(shù)%,，100%-對照管死細胞數(shù)%)

注意事項

1. 胸腺細胞制備速度要快,，且需在冰浴中進行操作，以保持細胞活力,；

2. 抗Thy-1的單克隆抗體和補體的效價要在預(yù)實驗中確定,；

3. 細胞對照管死細胞數(shù)若超過5%，實驗需重新做,；

4. 細胞滴加到載玻片上后長時間放置不檢測也可導(dǎo)致假陽性反應(yīng),。

常見問題

一、實驗材料

1. 解剖器械(眼科剪,、眼科鑷),、平皿,、80～100目不銹鋼網(wǎng)；

2. 試管、1 ml吸量管,、尖吸管,；

3. 載玻片,、蓋玻片,；

4. C57BL/6J小鼠；

5. 含5%NBS的冷Hank’s液,；

6. 抗小鼠Thy-1的單克隆抗體（最適稀釋度,，本室制備）；

7. 補體(豚鼠新鮮血清并經(jīng)小鼠胸腺細胞吸收,，預(yù)先測定效價并稀釋為最佳稀釋度),；

8. 1%伊紅-Y染液。

二,、多重PCR的特點

1.高效性

在同一PCR反應(yīng)管內(nèi)同時檢出多種病原微生物,，或?qū)τ卸鄠€型別的目的基因進行分型，特別是用一滴血就可檢測多種病原體,。

2.系統(tǒng)性

多重PCR很適宜于成組病原體的檢測,，如肝炎病毒,，腸道致病性細菌，性病,，無芽胞厭氧菌,，戰(zhàn)傷感染細菌及細菌戰(zhàn)劑的同時偵檢。

3.經(jīng)濟簡便性

多種病原體在同一反應(yīng)管內(nèi)同時檢出,，將大大的節(jié)省時間,，節(jié)省試劑，節(jié)約經(jīng)費開支,，為臨床提供更多更準確的診斷信息,。

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