1. 每個時間點和每個樣品準(zhǔn)備 0.5 × 107 ~2 × 107 細胞，每 0 .5 × 107 ~2 × 107 細胞用 2 ml 0.1~0.2 mCi/ml [35S] 甲硫氨酸脈沖標(biāo)記 10~30 min （見基本方案步驟 1~4,，或見備擇方案 1 步驟 1~5）,。

2. 去除 [35S] 甲硫氨酸的工作溶液，用 10 ml 37℃ 的示蹤培養(yǎng)基洗一次,，并加入 10 ml 37℃ 的示蹤培養(yǎng)基,。

3. 37℃ 培養(yǎng)到預(yù)期時間,。擰緊試管蓋子在旋轉(zhuǎn)情況下培養(yǎng)細胞懸液,。在 032 培養(yǎng)箱里孵育貼壁細胞。

4. 刮取貼壁細胞并轉(zhuǎn)移到 15 ml 離心管,。收集刮取的細胞或細胞懸浮液于 4℃ 300 g 離心 5 min,。

5. 可選：通過 TCA 沉淀法測定標(biāo)記摻入的量（見輔助方案）。

注意事項

1. 將2倍體積含有過量未標(biāo)記甲硫氨酸（15mg/L）的示蹤培養(yǎng)基直接加入到標(biāo)記混合物中,，能夠快速終止標(biāo)記反應(yīng),。

2. 示蹤≤2 h，細胞懸液的最終濃度應(yīng)該是 2 × 106 細胞/ml,，或示蹤>2 h,，用 0.5 × 106 細胞/ml,。對貼壁細胞而言，加 10 ml/100 mm 平皿,。

常見問題

1. 上清可以棄掉,，也可以收集起來用于分析分泌或脫落到培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)。

2. 如果細胞沉淀不馬上使用的話,，見基本方案步驟7,。

同實驗其他方法

氨基酸代謝標(biāo)記實驗

1. 室溫融化 [35S] 標(biāo)記甲硫氨酸，并用預(yù)熱的（37℃）脈沖標(biāo)記培養(yǎng)基制備 0.1~0.2 mCi/ml 的工作溶液,。2. 室溫下 300 g 離心 5 min,，獲得懸液中 0.5 × 107~

備擇方案 1 對貼壁細胞

1. 在 100 mm 組織培養(yǎng)皿中培養(yǎng)細胞到 80%~90% 融合（0.5 × 107~2 × 107 細胞，取決于細胞類型）,。2. 如上所述制備 [35S] 甲硫氨酸的工作液體（見基本方案步驟 1

備擇方案 3 長期細胞標(biāo)記

1. 在預(yù)熱的 37℃ 長期標(biāo)記培養(yǎng)基中制備 0.02～0.1 mCi/ml [35S] 甲硫氨酸工作溶液（見基本方案步驟 1）,。2.1 對于懸浮細胞：用預(yù)熱的長期標(biāo)記培養(yǎng)基準(zhǔn)備并洗細胞一次

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備擇方案 2 示蹤標(biāo)記細胞

原理

材料與儀器

步驟

注意事項

常見問題

同實驗其他方法

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