材料與儀器

貼壁細(xì)胞 [35S]標(biāo)記L-甲硫氨酸（>800 Ci／mmol)／[35S]標(biāo)記蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物
PBS(冷凍) 37℃ 脈沖標(biāo)記培養(yǎng)基
100 mm 組織培養(yǎng)皿 配有液體同位素垃圾閥門的真空吸氣器

步驟

1. 在 100 mm 組織培養(yǎng)皿中培養(yǎng)細(xì)胞到 80%~90% 融合（0.5 × 107~2 × 107 細(xì)胞,，取決于細(xì)胞類型）,。

2. 如上所述制備 [35S] 甲硫氨酸的工作液體（見基本方案步驟 1）。

3. 吸棄上清并用 10 ml 預(yù)熱（37℃）脈沖標(biāo)記培養(yǎng)基輕柔洗細(xì)胞 2 次，棄掉洗液。

4. 加 5 ml 預(yù)熱脈沖標(biāo)記培養(yǎng)基,，在潮濕、37℃,、5% CO2 培養(yǎng)箱內(nèi)孵育 15 min,，以除去細(xì)胞內(nèi)的甲硫氨酸。

5. 棄掉細(xì)胞上的培養(yǎng)基，加入 2 ml [35S] 甲硫氨酸的工作液體（見步驟 2）,，在 CO2 培養(yǎng)箱內(nèi)孵育 10~30 min,。

6. 棄掉細(xì)胞上的培養(yǎng)基。用 10 ml 冷凍的 PBS 洗細(xì)胞并棄掉 PBS,。加 10 ml 冷凍的 PBS,，并用塑料刮子或橡膠細(xì)胞刮小心刮取收集細(xì)胞。

7. 轉(zhuǎn)移懸液到 15 ml 離心管中,，4℃,，300 g 離心 5 min，棄上清,。如果在標(biāo)記過程中細(xì)胞明顯脫落,，有必要將含有 [35S] 甲硫氨酸的工作液中的細(xì)胞小心刮取,，并將懸液轉(zhuǎn)移到 15 ml 離心管中,，在用 PBS 洗滌前離心,。

8. 可選：通過 TCA 沉淀法測定標(biāo)記摻入的量（見輔助方案）,。

注意事項(xiàng)

如果在標(biāo)記過程中細(xì)胞明顯脫落,，有必要將含有[35S]甲硫氨酸的工作液中的細(xì)胞小心刮取,， 并將懸液轉(zhuǎn)移到15 ml離心管中,，在用PBS洗滌前離心,。

常見問題

１. 實(shí)驗(yàn)材料中貼壁細(xì)胞,，如 HeLa,、NRK、Ml,、COS - 1、CV - 1,，或原代培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞,。

２. 如果細(xì)胞沉淀不馬上使用的話，見基本方案步驟7,。

同實(shí)驗(yàn)其他方法