一,、細(xì)胞誘導(dǎo)前可使用多聚賴(lài)氨酸溶液進(jìn)行細(xì)胞包被,以便細(xì)胞更好的進(jìn)行貼壁,。
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同學(xué)A:
使用細(xì)胞細(xì)胞包被液包被細(xì)胞培養(yǎng)板,,將傳代或復(fù)蘇凍存的人間充質(zhì)干細(xì)胞接種到6孔板上,密度為2×105 -3×105 cells/cm2或2×105 -3×105 cells/孔,置于37℃,,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),,當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到80%-90%時(shí),小心的將孔內(nèi)間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基吸掉,,向6孔板中加入2mL人間充質(zhì)干細(xì)胞脂肪分化培養(yǎng)基(此套裝包含基礎(chǔ)500ml,脂肪細(xì)胞分化因子:5ml,干細(xì)胞生長(zhǎng)維持因子:5ml,胎牛血清:25ml ),以此記為第0天,。
一,、細(xì)胞誘導(dǎo)前可使用多聚賴(lài)氨酸溶液進(jìn)行細(xì)胞包被,以便細(xì)胞更好的進(jìn)行貼壁,。
二,、每隔1-2天更換新鮮的人間充質(zhì)干細(xì)胞脂肪分化培養(yǎng)基;
注意:為防止脂肪細(xì)胞脫落,,建議誘導(dǎo)過(guò)程中出現(xiàn)大量脂肪細(xì)胞結(jié)節(jié)之后,,換液形式變?yōu)槊刻煲淮伟肓繐Q液。
三,、 誘導(dǎo)14-21天期間,,視細(xì)胞的形態(tài)變化及生長(zhǎng)情況進(jìn)行染色。
以下是總結(jié)的染色方法
脂肪油紅染色,,有的是動(dòng)物/人體脂肪組織切片,,或細(xì)胞爬片。各有操作稍有差異,。
一
*成熟飽滿(mǎn)的脂肪細(xì)胞,,容易破裂,脂滴泄漏,,所以壓片,,切片都要考慮到這個(gè)問(wèn)題。
二
細(xì)胞爬片細(xì)胞溶液脫落,,特別是脂滴大的,。操作務(wù)必要輕柔。不要把細(xì)胞沖掉,。
三
如果做脂肪組織冰凍切片,,冰凍切片要適當(dāng)厚一些,一般為10-15µm,,切片太薄容易導(dǎo)致脂肪流失
四
如果培養(yǎng)載體為塑料制品,,hoechst33342染核的話(huà),塑料板自發(fā)熒光也為藍(lán)色,,必須考慮波長(zhǎng),,激發(fā)波長(zhǎng)/發(fā)射波長(zhǎng)=485nm/572nm
誘導(dǎo)的小鼠MMSC-BM的成脂肪細(xì)胞
五
染色步驟:
(1) 先小心輕緩倒去培養(yǎng)液。
(2) 用pbs輕緩漂洗。
(3)加10%中性甲醛或者95%以上的酒精固定30min以上
(4) 稀釋改良型即用油紅染色試劑盒,,油紅:PBS=3:2,,室溫放置10min
(5)染色10-20min左右,加的體積覆蓋住板底即可,,如6孔加1.5ml,,24孔加0.5-1ml。
(6)脫色,,用75%酒精/60%異丙醇漂洗,,除去多余的染料
(7) 復(fù)染,淡蘇木染色1/5分鐘,,pbs漂洗(這一步不做也可,,看試驗(yàn)需要,并且蘇木素會(huì)把胞漿染紅,,如要顯示核,, hoechst33342也可以,濃度5微克/毫升染10分鐘即可把核染上),。
(8)甘油明膠封片(封片后可長(zhǎng)期保存),。
(9) 若不用明膠封片,請(qǐng)盡快拍照,。
同學(xué)B:
油紅O染色試劑盒在傳代培養(yǎng)中,,接種密度是影響體外培養(yǎng)間質(zhì)干細(xì)胞增殖潛能的重要因素。低密度接種時(shí),,間質(zhì)干細(xì)胞的增殖能力明顯提高,,而誘導(dǎo)細(xì)胞分化時(shí)則需要較高的細(xì)胞密度,這可能與分化時(shí)細(xì)胞與細(xì)胞間的相互作用有關(guān),。而在培養(yǎng)過(guò)程中,,若細(xì)胞過(guò)度融合會(huì)促進(jìn)其分化趨向,故要保持干細(xì)胞未分化狀態(tài),,要及時(shí)傳代,。
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