一．RAW264.7細(xì)胞背景介紹
細(xì)胞取材于Abelson小鼠白血病病毒誘發(fā)的腫瘤組織,，是科研上尤為常用的炎癥細(xì)胞模型之一,。該細(xì)胞易于增殖,，有高效DNA轉(zhuǎn)染力,，對(duì)RNA干擾敏感，常用作轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞和復(fù)制小鼠諾如病毒,。細(xì)胞有sIg-,、Ia-、Thy-1.2抗原陰性,。據(jù)報(bào)道,，該細(xì)胞建系后已不分泌且檢測(cè)不到病毒顆粒,，XC斑點(diǎn)形成實(shí)驗(yàn)陰性?？梢钥贵w依賴(lài)性地分解綿羊紅血球與腫瘤靶細(xì)胞,，LPS或PPD處理2天后可誘導(dǎo)分解紅血球但對(duì)腫瘤靶細(xì)胞無(wú)作用,。
二．RAW264.7細(xì)胞形態(tài)特征
1,、RAW264.7細(xì)胞一般為圓形或橢圓形，細(xì)胞核為圓形或橢圓形,，染色較深,。貼壁特別牢固。若細(xì)胞呈多角形時(shí),，細(xì)胞為激活狀態(tài),。
2、RAW264.7具有吞噬能力,，當(dāng)細(xì)胞吞噬抗原后,，細(xì)胞會(huì)釋放趨化因子，進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞伸出偽足,，增強(qiáng)粘附攀爬能力,。若細(xì)胞吞噬抗原過(guò)多、培養(yǎng)環(huán)境惡劣,，細(xì)胞剛傳完代比較稀疏的時(shí)候,，都會(huì)讓該細(xì)胞呈現(xiàn)梭形、長(zhǎng)梭形,，鏡下會(huì)看到具有細(xì)長(zhǎng)偽足的小細(xì)胞被類(lèi)似上皮的梭形細(xì)胞,。
3、這個(gè)細(xì)胞屬于慢熱型的,，很難消化,，消化時(shí)間不夠則導(dǎo)致細(xì)胞無(wú)法消化下來(lái)，消化時(shí)間太長(zhǎng),，傳代之后就會(huì)長(zhǎng)個(gè)角給你看看,，使勁吹打和細(xì)胞刀刮下來(lái)，則傳代之后不只是長(zhǎng)個(gè)角給您看看了,，還會(huì)飄起很多小黑點(diǎn),，而且這種細(xì)胞傳代時(shí)接種密度要大，否則也容易使巨噬細(xì)胞分化,，細(xì)胞變形,，并且不能恢復(fù)，這是培養(yǎng)這種細(xì)胞時(shí)最需要注意的問(wèn)題,。
4,、RAW264.7細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)喜歡結(jié)伴。正常生長(zhǎng)狀態(tài)應(yīng)該是一小片一小片的生長(zhǎng)，片片之間不連接,，等到長(zhǎng)到更多更密的時(shí)候會(huì)連成大片,，并疊加成層。疊加成層的細(xì)胞需要更多的營(yíng)養(yǎng),，一旦營(yíng)養(yǎng)跟不上,，細(xì)胞也會(huì)長(zhǎng)個(gè)角給你瞅瞅，所以需要在細(xì)胞疊加的時(shí)候進(jìn)行操作,。
5,、RAW264.7細(xì)胞傳代后貼壁迅速，半小時(shí)就能貼上一大片,，剛貼壁是細(xì)胞呈圓形,，折光度很好，鏡下觀察如小珍珠狀一個(gè)個(gè)地散落于瓶底面,。若這個(gè)時(shí)候覺(jué)得活化的細(xì)胞較多,，即長(zhǎng)梭形的細(xì)胞較多時(shí)，可在細(xì)胞傳代消化重新貼壁半小時(shí)后進(jìn)行換液,，只保留生長(zhǎng)狀況較好的細(xì)胞,。
6、RAW264.7細(xì)胞的生長(zhǎng)對(duì)血清要求比較高,，血清不好會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)情況變差,。這是一個(gè)大胃王，所以在看到培養(yǎng)基變黃的時(shí)候不要遲疑,，立馬換液處理,。
三、培養(yǎng)中的注意事項(xiàng)及傳代步驟
1,、培養(yǎng)之前,，一切與細(xì)胞接觸的玻璃器皿和器具都要進(jìn)行熱源處理。（200-250℃烘烤4-6h）
我們的消化及傳代方法：
方法一,、消化液：0.5%胰酶,、0.2EDTA，實(shí)驗(yàn)前加溫到37℃以T25培養(yǎng)瓶為例：
1,、細(xì)胞貼壁生長(zhǎng),，長(zhǎng)滿(mǎn)瓶底的95%時(shí)，棄去培養(yǎng)液,，加D-HANKS漂洗兩次,；
2、加入胰酶和EDTA的消化液1-2ml,，消化37℃約2-5min,，鏡下可看見(jiàn)細(xì)胞基本脫落即終止消化,，收集消化后的細(xì)胞；（因?yàn)榈讓拥募?xì)胞一般長(zhǎng)有偽足,，它緊緊的貼在瓶壁上,，更難消化，消化時(shí)可先收集上層細(xì)胞,，然后再消化底層細(xì)胞,，每次消化下來(lái)的細(xì)胞不能放在同一瓶里）。
3,、加入D-HANKS漂洗兩次,，加入胰酶和EDTA的消化液1-2ml,，37℃消化約2-5min,，繼續(xù)消化底層的細(xì)胞，鏡下可看見(jiàn)細(xì)胞基本脫落即終止消化,，單獨(dú)收集消化后的細(xì)胞,；
4、加入新培養(yǎng)液10ML輕輕彈散混懸細(xì)胞,，按需要分入新的培養(yǎng)瓶中,，37℃CO2培養(yǎng)箱，幾小時(shí)后即可貼壁,。
四,、凍存的注意事項(xiàng)：
1、RAW264.7的凍存過(guò)程應(yīng)盡量減少熱源對(duì)細(xì)胞的影響,，這樣對(duì)細(xì)胞種子的潔凈度有更好的保障,。
2、這種細(xì)胞對(duì)空間狀態(tài)很敏感,，所以復(fù)蘇的細(xì)胞密度或復(fù)蘇細(xì)胞數(shù)量控制在10^4-10^5為宜,，這種接種密度接種在75cm2培養(yǎng)瓶中養(yǎng)2天后細(xì)胞密度即可到達(dá)70-80%，若細(xì)胞在復(fù)蘇的時(shí)候有偽足,，先讓細(xì)胞生長(zhǎng)到堆疊起來(lái),，然后再進(jìn)行傳代，底部細(xì)胞棄掉,，盡量選擇好的血清培養(yǎng),，可讓新生細(xì)胞慢慢達(dá)到未激活狀態(tài)。
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