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制備YAC DNA進(jìn)行Southern印跡分析

時(shí)間：2021/12/24閱讀：1165
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材料與儀器

酵母菌
AHC SCE SCEM Tris·Cl EDTA TE 乙酸甲 RNase A 異丙醇 NaCl
培養(yǎng)箱 離心管 轉(zhuǎn)子

步驟


1.  接種一個(gè)紅色的含YAC克隆的酵母菌落于盛有20 ml AHC培養(yǎng)基的250 ml 三角燒瓶中,，在旋轉(zhuǎn)搖床上30℃ 250 r/min 振蕩培養(yǎng)24 h。
 
2.  擴(kuò)大培養(yǎng)：取1ml 由步驟1獲得的粉紅色菌懸液接種于盛有100 ml AHC培養(yǎng)基的 1 000 ml三角燒瓶中,，于30℃ 250 r/min搖床培養(yǎng)24 h,。

3.  將菌懸液移入2個(gè)50 ml 的錐形離心管中,，于2 000 g 離心5 min，棄上清,，共用5 ml SCE緩沖液重懸菌體,，并合并到一個(gè)試管中。

4.  加1 ml SCEM緩沖液,，在旋轉(zhuǎn)搖床中37℃ 100 r/min 輕搖晃混勻,。

5.  于4℃ 2 000 g 離心棄上清，菌體用5 ml Tris/EDTA裂解液重懸。

6.  加0.5 ml 10%SDS顛倒混合數(shù)次,，于65℃溫育20 min,。
 
7.  加2 ml 冰浴的5 mol/l pH4.8的乙酸甲緩沖液，顛倒混合數(shù)次后置于冰浴60 min,。

8.  于室溫2 000 g 離心10 min,，小心將含核酸的上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)新管中。加室溫2倍體積的95%乙醇,，顛倒混勻,。

9.  于室溫2 000 g 離心5 min，棄上清,，在室溫晾干10~15 min,，分別加入3 ml TE緩沖液，pH8.0于37℃過夜溶解核酸,。

10.  加入0.1 ml 的1 mg/ml 無DNA酶活性的RNase A，于37℃溫育1 h,。
 
11.  加入6 ml 室溫的異丙醇,，振蕩并顛倒混勻后用一支毛細(xì)管纏繞起染色體，然后溶于0.5 ml TE緩沖液中,。

12.  加入50 μl 5 mol/l NaCl和2 ml 95%乙醇,，顛倒混勻。

13.  再一次纏繞起染色體DNA,，并溶于0.5 ml TE緩沖液中,，于4℃保存?zhèn)溆谩?/div> 
14.  取毎小份2 μg 的YAC DNA和15 μg 用以構(gòu)建YAC文庫的某物種或個(gè)體的基因組DNA。

15.  采用幾種高頻切割的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切,，接著用單拷貝探針進(jìn)行雜交和核酸印跡分析,。
 
16.   一旦通過核酸印跡實(shí)驗(yàn)確證YAC克隆，那么可通過制備染色體凝膠校塊塞和進(jìn)行脈沖電場(chǎng)凝膠電泳,，來明確重組YAC的大小并對(duì)其穩(wěn)定性進(jìn)行初步評(píng)價(jià),。


同實(shí)驗(yàn)其他方法

YAC 克隆的分析實(shí)驗(yàn)

1.  用接種棒將含重組載體pYAC的AB1380菌株劃線接種在AHC平板上，倒扣平板于30℃培養(yǎng),，直至長(zhǎng)出1~3 mm 大小的紅色菌落為止,。 2.  短期保存：用Parafilm膜將平

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