步驟
1. 制作每塊凝膠時,，首先要用肥皂及水小心嚴格地清洗兩塊30 cm×40 cm的前后玻璃平板,，用去離子水沖洗后晾干,，用噴射洗瓶噴10%乙酵或異丙醇使平板濕海,。
2. 然后用Kimwipe紙或其他無絨紙巾將平板擦干,。
3. 戴手套在通風櫥工作,，用浸濕了含5%二甲基二氯硅烷的氯仿溶液的Kimwipe紙在每片平板的其中一面加一層此溶液，并小心洗擦拭整面平板,。
4. 待硅化層干后,，用Kimwipe紙以70%乙醇或異丙醇擦凈并干燥，最后再檢查平板有沒有灰塵或其他物質,。
5. 按廠商指南用0.2~0.4 mm 均厚的墊片和大的書本裝訂夾子組裝凝膠膠模夾層,，注意墊片與平板的邊、底壓緊對齊,。
6. 制作每塊凝膠時,，在100 ml 燒杯配制60 ml 所需的變性丙烯酰胺凝膠溶液，在灌膠（步驟7）前,，*混勻60 μl TEMED和0.6 ml 10%過硫酸銨于每份丙烯酰胺溶液中,。
7. 立即灌膠，用60 ml 注射器小心吸出丙烯酰胺溶液,，避免吸入氣泡,，讓短平板朝上， 并使凝膠平板夾層與臬面成45度角,，沿著平板的一邊慢慢將丙烯酰胺溶液推入兩片平板之間,，其間可調整角度讓膠液慢饅流入夾層的一邊。
8. 當溶液達到短平板的頂部時,，放下膠模夾層至其頂部邊緣離操作臺平面仍有5 cm 左右,，其下墊一空的吸頭盒或其他物件以使之保持較低的角度。
9. 將0.2~0.4 mm 厚的鯊魚齒樣品梳的平齊一側插入膠液中,，至短平板下約2~3 mm,，操作須十分小心以避免產生氣泡，用一個書本裝訂夾將平極之間的樣品梳夾緊,，以避免在掩子與平板間形 成凝膠固塊,。
10. 加一層過量的丙烯酰胺溶液至梳子，保證其被*覆蓋,。用水沖洗注射器,，除去過量的丙烯酰胺。
11. 除去每片膠模夾層的底部墊片或膠帶,，用刀片除去樣品瓶周圍的過量聚丙烯酰胺凝膠,。
12. 用水清洗平板表面溢出的尿素和丙烯酰胺溶液,，從每片膠模夾層中撥去鯊魚齒樣品梳,，避免拉傷凝膠頂部。
13. 用水清洗梳子,，準備好在步驟16操作時重新插回樣品孔,。如果用常規(guī)樣品梳，小心防止撕裂聚丙烯酰胺加樣孔，
14. 凝膠電泳裝置的下層貯液槽加入1XTBE緩沖液,，使凝膠夾層能浸泡在2~3 cm 的一層緩沖液中,，放入凝膠夾層并用夾子固定在電泳裝置上。
15. 上層貯槽倒入1×TBE緩沖液,，使超過凝膠頂部約3 cm,，用巴斯德吸管或Beral細管以1×TBE清洗凝膠頂部。
16. 將清洗干凈的鯊魚齒樣品梳重新播回凝膠夾層,，使其齒部僅可觸及凝膠,，用巴斯德吸管或Beral細管以1×TBE緩沖液*清洗加樣孔，以除去零星的聚丙烯酰胺碎片,。
17. 加樣前,，在45 V/cm 凝膠的電壓降下預電泳，使凝膠預熱,，即在1 700 V,，70 W 恒功率下電泳約30 min。
18. 在加樣前,，清洗加樣孔除去浸進孔中的尿素,。
19. 在甲酰胺/染料溶液中的樣品，蓋好蓋子,，在95℃加熱2 min,，然后置于冰上，每孔加 樣2~3 μl 測序用的加樣吸頭可于每次加樣后在下槽緩沖液中沖洗2次后繼續(xù)使用,。
20. 在45~70 W 恒功率下電泳,，凝膠溫度保持在約65℃。
21. 高于此溫度可能會造成玻璃平板炸裂或條帶彌散,，而太低溫度可使測序產物不*變性,、現察標志染料的遷移以確定電泳時間。
22. 將干冰加入干膠機的冷阱并預熱至80℃,。
23. 電泳完畢時,，排出上下液槽的緩沖液，并按放射性廢物處理丟棄液體,。
24. 從電泳裝置中取出凝膠夾層,，并在冷自來水下沖洗直至兩面玻璃平板表面都冷卻為止，將夾層平放在紙巾上,，四口玻璃平板（短平板）朝上,，除去多余的液體及夾子、膠帶,，取出一邊的墊片,。
25. 兩片玻璃平板之間插入一個長金屬鏟子,，輕輕轉動鏟于將玻璃 平板橇起使之分開，凝膠應貼在下面的玻璃平板,，如果貼在上面的平板,，則將它翻轉過來。
26. 從插有鏟子的一邊饅慢提起上面的平板,，遂漸增加角度直至上層平板*與凝膠分離,。
27. 一旦平板分離后，取去另一邊的墊片及除去凝膠周圍多余的聚丙烯酰胺碎片,。
28. 如果樣品含32P或33P,，固定步驟可用可不用。如果樣品含33S,，直接將凝膠連同玻璃平板一起放入淺托盤中,，輕輕覆蓋一層約2 cm 的5%乙酸 / 5%甲醇固定液，浸泡10~15 min,，不時輕輕搖動托盤使凝膠與玻璃平板松開,。
29. 將疑膠重新置于平板上，靠吸力或重力除去固定液注意保持凝膠處于平極的中央,， 小心從托盤中將平板連同凝膠取出,，放在工作平臺上。
30. 將兩張干的轉印紙,，疊齊如 同一張一祥,，從凝膠的一端開始緩慢地向另一端放下，貼在凝膠的表面,，小心防止在紙和凝膠間形成氣泡,。
31. 從平板上剝起轉印紙，凝膠應和它一起被揭起,，逐漸卷起紙,，而凝膠就同它一起被剝離平板。
32. 將濾紙和凝膠放在預熱的干膠機中,，上面覆蓋一張保鮮瞑,，80℃處理20 min ~1 h，使凝膠*干燥,。
33. 從干膠上揭去保鮮膜,，將干膠放在X光曝光盒中，Kodak XAR-5X光膠片直接與凝膠接觸,，室溫放射自顯影,，經足夠時間曝光后（一般需過夜）取出X光膠片并沖印。
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