本期分享第三期的細(xì)胞培養(yǎng)常見問題的內(nèi)容,，希望對(duì)大家有所幫助啦~

20. 如果細(xì)胞發(fā)生微生物污染時(shí)，應(yīng)如何處理,？

原則上：直接滅菌后丟棄之,。

當(dāng)重要的培養(yǎng)污染時(shí),，研究者可能試圖消除或控制污染。首先,，確定污染物是細(xì)菌、真菌,、支原體或酵母，把污染細(xì)胞與其它細(xì)胞系隔離開,，用實(shí)驗(yàn)室消毒劑消毒培養(yǎng)器皿和超凈臺(tái)，檢查HEPA過濾器,。

高濃度的抗生素和抗霉菌素可能對(duì)一些細(xì)胞系有毒性,，因而,，做劑量反應(yīng)實(shí)驗(yàn)確定抗生素和抗霉菌素產(chǎn)生毒性的劑量水平,。這點(diǎn)在使用抗生素如兩性霉素B和抗霉菌素如泰樂菌素時(shí)尤其重要。下面是推薦的確定毒性水平和消除培養(yǎng)污染的實(shí)驗(yàn)步驟,。

(1)  在無抗生素的培養(yǎng)基中消化,、計(jì)數(shù)和稀釋細(xì)胞,，稀釋到常規(guī)細(xì)胞傳代的濃度,。

(2)  分散細(xì)胞懸液到多孔培養(yǎng)板中，或幾個(gè)小培養(yǎng)瓶中,。在一個(gè)濃度梯度范圍內(nèi)，把選擇抗生素加入到每一個(gè)孔中,。例如,，兩性霉素B推薦下列濃度,，0.25,，0.50，1.0,，2.0,，4.0,，8.0 mg/ml。

(3)  每天觀測細(xì)胞毒性指標(biāo)，如脫落,，出現(xiàn)空泡，匯合度下降和變圓,。

(4)  確定抗生素毒性水平后,，使用低于毒性濃度2～3倍濃度的抗生素的培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞2～3代。

(5)  在無抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞一代,。

(6)  重復(fù)步驟4,。

(7)  在無抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)4～6代,，確定污染是否以已被消除,。

21. 支原體(mycoplasma) 污染的細(xì)胞,， 是否能以肉眼觀察出異狀,？

不能,。除極有經(jīng)驗(yàn)之專家外,，大多數(shù)遭受支原體污染的細(xì)胞株，無法以其外觀分辨之,。

22. 支原體污染會(huì)對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)有何影響,？

支原體污染幾乎可影響所有細(xì)胞的生長參數(shù)，代謝及研究的任一數(shù)據(jù),。故進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前,，必須確認(rèn)細(xì)胞為mycoplasma-free,，實(shí)驗(yàn)結(jié)果的數(shù)據(jù)方有意義,。

23. 偵測出細(xì)胞株有支原體污染時(shí),， 該如何處理,？

直接滅菌后丟棄,，以避免污染其它細(xì)胞株，但是如果您的樣本珍貴,，建議您使用支原體去除試劑去除污染

24. CO2 培養(yǎng)箱的水盤如何保持清潔？

定期(至少每兩周一次) 以無菌蒸餾水或無菌去離子水更換之,。

25. 為何培養(yǎng)基保存于4℃ 冰箱中， 顏色會(huì)偏暗紅色,，且pH值會(huì)越來越偏堿性,？

培養(yǎng)基保存于4℃冰箱中，培養(yǎng)基內(nèi)的CO2會(huì)逐漸溢出,，造成培養(yǎng)基越來越偏堿性,。而培養(yǎng)基中的酸堿指示劑(通常為phenol red) 的顏色也會(huì)隨堿性增加而更偏暗紅。培養(yǎng)基偏堿的結(jié)果,，將造成細(xì)胞生長停滯或死亡,。若培養(yǎng)基偏堿時(shí),，可以通入無菌過濾的CO2，以調(diào)整pH 值,。

26. 各種細(xì)胞培養(yǎng)用的dish,，flask是否均相同,？

不同廠牌的dish 或flask，其所coating 的polymer 不同,，制造程序亦不同,，雖對(duì)大部分細(xì)胞沒有太大之影響，惟少數(shù)細(xì)胞則可能因使用廠牌不同的dish 或flask 而有顯著的生長差異,。

27. 購買的細(xì)胞冷凍管經(jīng)解凍后,，為何會(huì)發(fā)生細(xì)胞數(shù)目太少的情形,？

研究人員在冷凍細(xì)胞的培養(yǎng)時(shí)出現(xiàn)細(xì)胞數(shù)目太少,，大都是因?yàn)殡x心過程操作上的失誤，造成細(xì)胞的物理性損傷,，以及細(xì)胞流失,。建議細(xì)胞解凍后不要立刻離心,，應(yīng)待細(xì)胞生長隔夜后再更換培養(yǎng)基即可。

28. 購買的細(xì)胞死亡或細(xì)胞存活率不佳可能原因,？

研究人員在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)出現(xiàn)存活率不佳，常見原因可歸納為：培養(yǎng)基使用錯(cuò)誤或培養(yǎng)基品質(zhì)不佳,。血清使用錯(cuò)誤或血清的品質(zhì)不佳。解凍過程錯(cuò)誤。冷凍細(xì)胞解凍后,，加以洗滌細(xì)胞和離心,。懸浮細(xì)胞誤認(rèn)為死細(xì)胞,。培養(yǎng)溫度使用錯(cuò)誤,。細(xì)胞置于-80℃太久。

29. 如何避免沉淀物的產(chǎn)生?

我們建議您在使用血清的時(shí)候,，注意下列的操作:

(1)  解凍血清時(shí)，請按照所建議的逐步解凍法(-20℃至4℃至室溫),，若血清解凍時(shí)改變的溫度太大(如-20℃至37℃)，非常容易產(chǎn)生沉淀物,。

(2)  解凍血清時(shí)，請隨時(shí)將之搖晃均勻,，使溫度及成分均一，減少沉淀的發(fā)生,。

(3)  請勿將血清置于37℃太久,。若在37℃放置太久，血清會(huì)變得混濁,，同時(shí)血清中許多較不穩(wěn)定的成分也會(huì)因此受到損害,，而影響血清的質(zhì)量。

(4)  血清的熱滅活非常容易造成沉淀物的增多,，若非必要,，可以無須做此步驟,。

(5)  若必須做血清的熱滅活，請遵守56℃,，30分鐘的原則,，并且隨時(shí)搖晃均勻。溫度過高,，時(shí)間過久或搖晃不均勻,，都會(huì)造成沉淀物的增多,。

30.  L-谷氨酰胺在細(xì)胞培養(yǎng)中重要嗎？它在溶液中不穩(wěn)定嗎,？

L-谷氨酰胺在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)是重要的,。脫掉氨基后，L-谷氨酰胺可作為培養(yǎng)細(xì)胞的能量來源,、參與蛋白質(zhì)的合成和核酸代謝,。L-谷氨酰胺在溶液中經(jīng)過一段時(shí)間后會(huì)降解，但是確切的降解率一直沒有最終定論,。L-谷氨酰胺的降解導(dǎo)致氨的形成,，而氨對(duì)于一些細(xì)胞具有毒性。

31.  GlutaMAX-I是什么,？培養(yǎng)細(xì)胞如何利用GlutaMAX-I？這個(gè)二肽有多穩(wěn)定,？

GlutaMAX-I 二肽是一個(gè)L-谷氨酰胺的衍生物，其不穩(wěn)定的alpha-氨基用L-丙氨酸來保護(hù),。一種肽酶逐漸裂解二肽,，釋放L-谷氨酰胺供利用,。

GlutaMAX-I二肽非常穩(wěn)定，即使在121℃滅菌20分鐘,，GlutaMAX-I 二肽溶液有最小的降解,，如果在相同條件下,，L-谷氨酰胺幾乎*降解。

32. 什么培養(yǎng)基中可以省去加酚紅,？

酚紅在培養(yǎng)基中用作PH值的指示劑：中性時(shí)為紅色,，酸性時(shí)為黃色,，堿性時(shí)為紫色。研究表明,，酚紅可以模擬固醇類激素的作用，（特別是雌激素）,。為避免固醇類反應(yīng),，培養(yǎng)細(xì)胞,，尤其是哺乳類細(xì)胞時(shí)，不用加,。

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