接上一期，本期我們繼續(xù)分享細(xì)胞培養(yǎng)常見(jiàn)的問(wèn)題吧~

12. 附著性細(xì)胞繼代時(shí)所使用的trypsin-EDTA 濃度,？應(yīng)如何處理,？

一般使用的trypsin-EDTA 濃度為0.05% trypsin-0.53 mM EDTA Na4。 第一次開(kāi)瓶后應(yīng)立即少量分裝于無(wú)菌試管中,，保存于-20 ℃,，避免反復(fù)冷凍解凍造成trypsin 的活性降低，并可減少污染的機(jī)會(huì),。

13. 欲將一般動(dòng)物細(xì)胞離心下來(lái),，其離心速率應(yīng)為多少轉(zhuǎn)速？

回收動(dòng)物細(xì)胞,，其離心速率一般為300xg (約1 000 rpm),，5-10 分鐘，過(guò)高的轉(zhuǎn)速,，將造成細(xì)胞死亡,。

14. 細(xì)胞冷凍培養(yǎng)基的成份為何？

動(dòng)物細(xì)胞冷凍保存時(shí)最常使用的冷凍培養(yǎng)基是含5-10% DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90-95% 原來(lái)細(xì)胞生長(zhǎng)用的新鮮培養(yǎng)基均勻混合之,。注意：由于DMSO 稀釋時(shí)會(huì)放出大量熱能,，故不可將DMSO 直接加入細(xì)胞液中，必須使用前先行配制完成,。

15. DMSO 的等級(jí)和無(wú)菌過(guò)濾的方式為何,？

冷凍保存使用的DMSO 等級(jí)，必須為T(mén)issue culture grade之DMSO (如Sigma D2650),，其本身即為無(wú)菌狀況,，第一次開(kāi)瓶后應(yīng)立即少量分裝于無(wú)菌試管中，保存于4℃,，避免反復(fù)冷凍解凍造成DMSO 的裂解而釋出有害物質(zhì),，并可減少污染的機(jī)會(huì)。若要過(guò)濾DMSO,，則須使用耐DMSO 的Nylon 材質(zhì)濾膜,。

16. 冷凍保存細(xì)胞的方法？

冷凍保存方法一：冷凍管置于4℃ 30~60 分鐘→ (-20℃ 30 分鐘*) → -80℃16~18 小時(shí)(或隔夜) → 液氮槽vaporphase 長(zhǎng)期儲(chǔ)存,。

冷凍保存方法二：冷凍管置于已設(shè)定程序的可程序降溫機(jī)中每分鐘降1-3 ℃至-80℃以下,，再放入液氮槽vapor phase長(zhǎng)期儲(chǔ)存,。*-20℃不可超過(guò)1 小時(shí)，以防止冰晶過(guò)大,，造成細(xì)胞大量死亡,，亦可跳過(guò)此步驟，接放入-80℃冰箱中,，惟存活率稍微 降低一些,。

17. 細(xì)胞欲冷凍保存時(shí)， 細(xì)胞冷凍管內(nèi)應(yīng)有多少細(xì)胞濃度,？

冷凍管內(nèi)細(xì)胞數(shù)目一般為1x106 cells/ml vial,，融合瘤細(xì)胞則以5x106 cells/ml vial 為宜。 

18.培養(yǎng)基中是否須添加抗生素,？ 

除于特殊篩選系統(tǒng)中外,，一般正常培養(yǎng)狀態(tài)下，培養(yǎng)基中不應(yīng)添加任何抗生素,。

19. 應(yīng)如何避免細(xì)胞污染,？

細(xì)胞污染的種類(lèi)可分成細(xì)菌、酵母菌,、霉菌,、病毒和霉?jié){菌。主要的污染原因?yàn)闊o(wú)菌操作技術(shù)不當(dāng),、操作室環(huán)境不佳,、污染的血清和污染的細(xì)胞等。嚴(yán)格的無(wú)菌操作技術(shù),、清潔的環(huán)境,、與品質(zhì)良好的細(xì)胞來(lái)源和培養(yǎng)基配制是減低污染的最好方法。當(dāng)然,，適當(dāng)添加抗生素也是防止細(xì)胞污染的途徑,。

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