步驟
一,、實驗步驟
1. 拉頸處死24 小時內新生的SD大鼠,，75%乙醇浸泡5 min,，取出頭蓋骨,，分離頂骨和額骨,，冰生理鹽水液反復洗滌大鼠乳鼠顱蓋骨標本除去脂肪組織及殘留血,，放入另一盛有F12 *培基液的培養(yǎng)皿中再洗滌,， 將顱骨剪成2～5 mm2 碎片，將洗滌過的骨碎片用 0.25%胰蛋白酶2 ml 預消化15 min,，以清除纖維組織細胞,，棄去上清液(其中主要含成纖維細胞)。
2. 然后以0.1% Ⅱ型膠原酶10 ml,，在37℃環(huán)境中消化 20 分鐘,，室溫下磁力攪拌消化20 分鐘。靜置數(shù)分鐘,，收集消化液,，室溫下以1200 rpm離心10 分鐘。去除上清液,，用20% 胎牛血清的F12 培養(yǎng)液4 ml 懸 浮細胞,，接種于75 ml 培養(yǎng)瓶中，補培養(yǎng)液8 ml 使每瓶液體量達到12 ml,；對靜置后沉淀部分可再重復以膠原酶消化20 分鐘,、磁力攪拌消化15 分鐘、離心10 分鐘,，將獲得的3 瓶細胞放置于二氧化碳培養(yǎng)箱,，在5% CO2，95%空氣,，37℃溫度下培養(yǎng),，24 小時后可見細胞貼壁生長，胞質開始伸展,，換新鮮培養(yǎng)液,，以后每隔48 小時換培養(yǎng)液(注：消化視具體情況而定，也可多消化 1 遍),。
3. 原代培養(yǎng)一般接種后第7 天能長滿,。傳代時，取生長良好、貼壁松緊適度的成骨細胞 1 瓶,，棄去培養(yǎng) 液,，傳代時先以 PBS 沖洗 2 遍，加 0.25%胰酶1 ml,，室溫下消化3～5 分鐘,，將胰蛋白酶液棄去，加 F12 培養(yǎng)液充分吹打8-10 分鐘,。將已消化的細胞收集,、合并，計數(shù),；用 F12 *培基調節(jié)至細胞濃度為合適濃 度,。一般取2-5 代成骨細胞進行實驗。代數(shù)太多,，細胞老化或者分化明顯,。
二、結果
如圖所示,，成骨細胞的形狀和成纖維細胞非常相似,，但是不同的是，比成纖維細胞更不容易消化,，尤 其是傳代次數(shù)多，細胞老化的時候,，非常難消化,，并且不易消化成單個細胞。
圖1：成骨細胞
圖2：成骨細胞100倍
圖3：成骨細胞形成的礦化結節(jié)
三,、鑒定的方法
1. 堿性磷酸酶(ALP)活性檢測
2. 骨玻璃樣蛋白(BGP)檢測
3. 礦化結節(jié)檢測
