步驟
一,、實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備
1. 動(dòng)物：雄性SD大鼠(體重250-450 g),。
2. 試劑：戊巴（匕匕）妥鈉,，小牛血清(或胎牛血清，則更好),，DMEM,，酶消化液I、Ⅱ(以HBSS配),，18% Nycodenz(以GBSS配),，D-Hanks' 液(KCl 0.4 g/L，KH2PO4 0.06 g/L,，NaCl 8.0 g/L,，NaHCO3 0.35 g/L，Na2HPO4·7H2O 0.06 g/L或Na2HPO4 0.053 g/L,，可加酚紅 0.02 g/L),，HBSS，臺(tái)盼蘭等,。
3. 器械：手術(shù)器械,，200目尼龍網(wǎng)，相差顯微鏡,，熒光顯微鏡,。
二、原代培養(yǎng)方法
1. 大鼠腹腔麻醉后在超凈臺(tái)上剖腹,，進(jìn)行門靜脈插管,，以D-Hanks'液灌注，同時(shí)剪開(kāi)下腔靜脈,，沖掉血液后,，改灌以100 ml酶消化液I(0.05% IV型膠原酶)。
2. 待肝臟變軟后,，離體肝臟并剪碎,，繼續(xù)以酶消化液II(含20 U/ml DNase I的0.05% IV型膠原酶)消化15 min,，尼龍網(wǎng)過(guò)濾后以450 g 離心5 min(4℃，下同),。
3. 以HBSS重懸沉淀至10 ml,，再混以20 ml Nycodenz液，分置于離心管中,，并分別覆以2-3 ml HBSS,，1450 g離心16 min后取界面細(xì)胞。
4. 以HBSS重懸后再次離心收集細(xì)胞,，以DMEM重懸后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),，并判斷存活率和產(chǎn)量，最后按照常規(guī)方法接種(105細(xì)胞/cm2),，次日換液,，以后每2-3天換液一次。
三,、傳代方法
棄去培液后以D-Hanks'液洗兩次,，加0.125%胰酶(原代最好加0.05% EDTA)消化，鏡下觀察細(xì)胞突起回縮(2-5 min左右),，以*培液(DMEM+10% NBS)終止反應(yīng)(若不用EDTA,，可以不需離心)，充分吹打后以1:2-1:3接種,，然后繼續(xù)培養(yǎng)(5%CO2,，37℃)。
四,、 結(jié)果
接種次日,，光鏡下可見(jiàn)細(xì)胞呈星芒狀，胞質(zhì)內(nèi)有脂滴,，熒光鏡下328 nm處見(jiàn)自發(fā)熒光,。附上發(fā)表于Biochem Biophys Res Commun 2004年文章的照片(圖1)。
