步驟
一,、實驗材料準備
1. 動物
出生后1-4天的Wistar乳鼠1只,。
2. 試劑
PBS、培養(yǎng)液(Hyclone的低糖DMEM,，含Hyclone的10%新生牛血清,、100 U/ml 青鏈霉素、1%明膠PBS、0.25%胰酶(含EDTA,，GIBCO),，碘酒和酒精綿球。
3. 器械
眼科直剪2把,、眼科彎剪2把,、眼科直鑷2把、眼科彎鑷2把,、玻璃平皿3套,，25 cm2塑料培養(yǎng)瓶(Costar)。
二,、具體操作
1. 明膠包被培養(yǎng)瓶過夜(準備2-3個),，取出明膠，用2 ml培養(yǎng)液沖洗培養(yǎng)瓶一遍,，置于超凈臺中,。
2. 解剖取肺：將乳鼠在酒精中浸泡后取出，轉移至超凈臺上的玻璃培養(yǎng)皿中,，用碘酒消毒胸部皮膚,，再用酒精棉球脫碘。左手捏緊乳鼠頸背部皮膚以充分展露胸部,，右手以眼科直剪剪開皮膚,，充分撕拉開，再用酒精棉球消毒,，繼而以另一把眼科彎剪沿胸骨柄左下緣向上剪開肋骨,，然后在切口中間橫剪胸骨。用眼科鑷取出肺,，置于盛有PBS(含有200 U/ml青鏈霉素)的玻璃平皿中,，沖洗去血。
3. 用眼科剪將肺分成幾個肺葉,，用鑷子去除周邊的血凝塊及纖維組織,，用眼科剪剪去肺門處的支氣管和血管，再用含有雙抗的PBS沖洗1遍,。
4. 用眼科彎剪將肺組織剪碎成1 mm3大小，加入含有雙抗的PBS,，將肺組織塊吹打開,，靜置15 min后，更換新的PBS,。
5. 用200 ul微量加樣器(最好是超凈臺中專用的,，臨用時用酒精綿球好好擦拭槍柄)取200 ul加樣槍頭一個，剪去尖，在酒精燈上用火焰燒彎,。用槍頭吸取組織塊接種于培養(yǎng)瓶中,，每瓶20-25塊左右，每小塊間距0.5 cm左右,。組織塊放置好后,，輕輕將培養(yǎng)瓶翻轉，讓瓶底朝上,，向瓶內加入2 ml左右的培養(yǎng)液,，蓋好瓶蓋，將培養(yǎng)瓶傾斜放置在溫箱中,，干貼壁2-4 h后,，將培養(yǎng)瓶慢慢翻轉平放，繼續(xù)靜置培養(yǎng),。注意上述操作過程中動作要輕柔,，讓液體慢慢覆蓋組織小塊，嚴禁動作過快致使液體產(chǎn)生的沖力使粘貼的組織塊漂起而造成原代培養(yǎng)失敗,。48 h后換液,，更換2-3 ml即可。
6. 貼塊貼壁72 h后,，鏡下可見大量的成纖維細胞爬出,，將組織塊去除，繼續(xù)培養(yǎng)2-3天,，待細胞長滿,，即可傳代。注：因為血清濃度低,，內皮細胞可以爬出少量,，但是很快就會死掉。
2.7 傳代用0.25%胰酶常規(guī)消化,，以1:2傳代,，傳代完后，采用差速貼壁法純化一次,，即待細胞貼壁1.0 -1.5 h后(即絕大多數(shù)成纖維細胞都已經(jīng)貼壁),，棄去未貼壁的細胞和培養(yǎng)液，更換新的培養(yǎng)液,。
成纖維細胞為長梭形形態(tài),，常呈漩渦狀生長。
