細(xì)胞凍存與復(fù)蘇，是細(xì)胞培養(yǎng)過程中的常見工作。

細(xì)胞凍存，是指將細(xì)胞貯存在超低溫環(huán)境中,，使細(xì)胞暫時“冬眠"的技術(shù)，在需要的時候再進行復(fù)蘇,。

細(xì)胞復(fù)蘇,，是把凍存在-80℃冰箱或液氮中的細(xì)胞快速解凍，并使細(xì)胞重新恢復(fù)生長的技術(shù),。

本文將為大家介紹細(xì)胞凍存與復(fù)蘇的技術(shù)要點和操作步驟,。 

凍存原則為“慢凍"，即讓細(xì)胞在緩慢降溫的條件下逐漸冷凍。

如果直接將細(xì)胞懸液放在超低溫下快速冷凍,，細(xì)胞會受到冷凍損傷而死亡,。在凍存液中添加的保護劑（如DMSO、甘油）和在凍存盒中添加的異丙醇,，都起到程序性降溫的作用,。

DMSO能夠快速穿透細(xì)胞膜進入細(xì)胞中，延緩溫度下降速度,，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成,，從而起到保護細(xì)胞的作用。

需注意的是,，DMSO溶于培養(yǎng)基時,，將釋放大量熱量，所以凍存液需提前配制,，不能直接將DMSO加入含有細(xì)胞的培養(yǎng)基中,，避免燙傷細(xì)胞。

另外,，DMSO屬于致癌物質(zhì),，使用時應(yīng)戴好手套，規(guī)范操作,。

程序凍存液成分一般由基礎(chǔ)培養(yǎng)基、胎牛血清,、DMSO組成,。血清比例為10%~90%，DMSO比例為5%~10%,。根據(jù)普諾賽實驗室經(jīng)驗,，推薦凍存液配比：55%基礎(chǔ)培養(yǎng)基＋40%胎牛血清＋5%DMSO，難養(yǎng)細(xì)胞可用90%胎牛血清＋10%DMSO凍存,。

細(xì)胞凍存和復(fù)蘇過程中,，不可避免會損失部分細(xì)胞，所以凍存的密度不能太低,。提高凍存密度有助于提升復(fù)蘇存活率,，推薦密度為100~300萬細(xì)胞/mL。

使用程序降溫盒是較為常用的凍存方法,。市面上的降溫盒有些需要添加異丙醇,，有些則不需要。

降溫盒須恢復(fù)室溫后再使用,。

根據(jù)普諾賽實驗室經(jīng)驗,，使用程序凍存盒凍存效果良好，沒有凍存盒的同學(xué)可以參照下文方法二和方法三。

無血清非程序凍存液是一種商品化的凍存液,，無需自己配制,，無需降溫盒，大大提升了便捷性,。

但是,，并非所有細(xì)胞都適用于這種凍存液，使用前必須做凍存測試,，沒問題后再批量應(yīng)用,。

▲ 使用無血清非程序凍存液操作示意圖

在沒有凍存盒或者非程序凍存液時，可以選擇手動梯度降溫,。但手動梯度降溫不適用于所有細(xì)胞,，且效果不穩(wěn)定，同樣需要先做凍存測試,。

▲ 手動梯度降溫操作示意圖

復(fù)蘇講究“快融",，越快融化，細(xì)胞所受損傷就越小,。細(xì)胞復(fù)蘇的操作不復(fù)雜,，但每一步都必須穩(wěn)扎穩(wěn)打，才能最大限度地提高復(fù)蘇存活率,。

步驟1：水浴鍋預(yù)熱至37℃?zhèn)溆?/strong>

步驟2：準(zhǔn)備15mL離心管,，并向其中加入適量培養(yǎng)基待用

步驟3：將細(xì)胞凍存管從-80℃冰箱或液氮中取出，放入PE手套中,，迅速投入水浴鍋

步驟4：用力搖晃凍存管，使其在1分鐘內(nèi)融化

步驟5：用紙巾擦拭水漬，轉(zhuǎn)移至生物安全柜,。用移液槍吸取細(xì)胞懸液，緩慢滴加到步驟2中準(zhǔn)備好的離心管

步驟6：1200rpm離心3分鐘

步驟7：棄上清,，用新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種至新的無菌培養(yǎng)器皿中

▲ 細(xì)胞復(fù)蘇操作示意圖

做完步驟7,，細(xì)胞就復(fù)蘇好了,。復(fù)蘇的細(xì)胞需要一段時間恢復(fù)狀態(tài)，當(dāng)復(fù)蘇后的細(xì)胞密度低于80%時,，48小時內(nèi)不要換液,，待細(xì)胞形態(tài)、生長速度等恢復(fù)正常,，再進行傳代等操作,。（不要因為復(fù)蘇后兩三天細(xì)胞狀態(tài)不好就丟棄，應(yīng)耐心等待至少一周,。）

當(dāng)然,，復(fù)蘇后細(xì)胞狀態(tài)很好的情況下，可以提前開始實驗,。