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細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)

時(shí)間:2021/10/29閱讀:1916
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簡介


一.細(xì)胞培養(yǎng)的基本原理

細(xì)胞培養(yǎng)是用酶消化法將組織碎塊分離成單個(gè)細(xì)胞,,用培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液,在體外適宜條件下,,使細(xì)胞生長繁殖,,并保留其一定的結(jié)構(gòu)和功能特性。細(xì)胞培養(yǎng)與組織培養(yǎng),、器官培養(yǎng)主要不同點(diǎn)在于原始培養(yǎng)的對象不同,。細(xì)胞培養(yǎng)使用的是單個(gè)細(xì)胞懸液,組織培養(yǎng)使用的是組織塊(0.5~1立方毫米)或薄片(厚0.2毫米),,而器官培養(yǎng)使用的是器官原基或器官的一部分或整個(gè)器官,。在組織培養(yǎng)中,細(xì)胞自組織塊周圍移出并生長,,細(xì)胞在生長過程中總有移動(運(yùn)動)或其它變動,,這樣就使被培養(yǎng)的組織難以長期維持其原有的結(jié)構(gòu)和功能。培養(yǎng)時(shí)間越長,,發(fā)生變化的可能性越大,,結(jié)果常使單一類型的細(xì)胞保存下來,最終成了細(xì)胞培養(yǎng),。在細(xì)胞培養(yǎng)中,,細(xì)胞生命活動和體內(nèi)細(xì)胞一樣,仍然是相互依存的,,呈現(xiàn)一定的組織特異性,,所以組織培養(yǎng)和細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)際上無嚴(yán)格區(qū)別。


細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是生命科學(xué)中常用的研究手段,,該方法能排除神經(jīng)體液因素的影響及肝,、腎解毒功能的干擾,觀察某些因素或藥物對培養(yǎng)細(xì)胞的直接作用,。通過實(shí)驗(yàn)可獲得某一類型細(xì)胞的純培養(yǎng),。如心肌組織中心肌細(xì)胞約占50%,非心肌細(xì)胞占50%,;而經(jīng)純化分離的心肌細(xì)胞懸液中,,心肌細(xì)胞可達(dá)95%以上,這樣,,心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)基本不受其它細(xì)胞的干擾,。在細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中能直接觀察到培養(yǎng)細(xì)胞生命活動的動態(tài)過程,;用定時(shí)顯微攝影記錄可發(fā)現(xiàn)一些肉眼觀察不到的生命現(xiàn)象;還可利用電鏡手段,、同位素標(biāo)記,、放免法和免疫組化法等來研究細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)及細(xì)胞內(nèi)化學(xué)物質(zhì)的分布。此外,,還能節(jié)約研究費(fèi)用,。如在某些研究中,用100只動物做實(shí)驗(yàn)所獲得結(jié)論與用100張蓋玻片或幾十個(gè)培養(yǎng)瓶而獲得結(jié)論具有相同的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,,而細(xì)胞培養(yǎng)較之大批量的動物飼養(yǎng)花費(fèi)要小,。


但細(xì)胞培養(yǎng)方法也存在不足之處:培養(yǎng)細(xì)胞失去體內(nèi)細(xì)胞的制約和整體的調(diào)節(jié)作用,細(xì)胞形態(tài)和功能會發(fā)生一定程度的改變,。培養(yǎng)方法,、實(shí)驗(yàn)試劑對細(xì)胞形態(tài)和功能有一定的影響,如胰蛋白酶可破壞細(xì)胞表面受體,、酶,、抗原等。長期體外培養(yǎng)的細(xì)胞,,由于反復(fù)傳代,、凍存和操作等因素的影響,可能發(fā)生染色體非整倍體改變,,呈永生化或癌變的特征,。



材料與儀器


二.細(xì)胞培養(yǎng)的基本設(shè)備與用品
(1)細(xì)胞培養(yǎng)的基本設(shè)備

細(xì)胞培養(yǎng)的基本設(shè)備有:CO2培養(yǎng)箱,,倒置顯微鏡,,凈化臺,壓力蒸汽消毒器,,自動雙重純水蒸餾器,,液氮罐,冰箱,,電熱干燥箱,,電熱恒溫培養(yǎng)箱,電動吸引器,,抽氣泵等,。

(2)常用的實(shí)驗(yàn)用品

1.玻璃器皿

細(xì)胞培養(yǎng)所用的玻璃器皿應(yīng)由透明度好、無毒的中性硬質(zhì)玻璃制成,。常用的有以下幾種:國產(chǎn)螺旋口培養(yǎng)瓶[有12.5毫升,,25毫升,100毫升等規(guī)格,,國外培養(yǎng)瓶常以底面積(平方厘米)表示],;培養(yǎng)皿(直徑有3.5厘米,,6厘米,9厘米,,10厘米等規(guī)格),;離心管(5毫升,10毫升),;注射器(1毫升,,5毫升等);用生理鹽水瓶代替的貯存瓶(100毫升,,250毫升,,500 毫升);青霉素瓶(5毫升),;西力辛瓶(10毫升),;其它還有尖吸管和移液管,載玻片(厚度0.8~1.2毫米),,蓋玻片(厚度0.12毫米),,貯存尖吸筒用的玻璃筒或金屬筒,漏斗,,燒杯,,量筒,貯蒸餾水瓶,,冷凍管(1.5毫升,,2毫升)等。

2.塑料品

多孔培養(yǎng)板規(guī)格有4,、6,、12、24,、96孔等,,培養(yǎng)皿直徑有3厘米、6厘米,、10厘米等,。塑料品經(jīng)消毒滅菌密封包裝,供一次性使用,,重復(fù)使用的需經(jīng)特殊方法清洗消毒,。塑料器材厚薄均勻,有的表面經(jīng)特殊處理,,細(xì)胞易于生長,。

3.器械

解剖刀、眼科剪和鑷(直頭和彎頭)、中號圓頭鑷,、止血鉗等,。

4.雜用品

金屬飯盒、試管架,、各種規(guī)格膠塞,、記號筆、搪瓷盤,、吸頭(吸取液體的膠帽),、酒精燈、酒精,、火柴,、碘酒棉球瓶等。

組織培養(yǎng)中使用最多的是吸管,、培養(yǎng)瓶,、培養(yǎng)皿及各種瓶塞。實(shí)驗(yàn)者手中應(yīng)有三套器材,,瓶塞數(shù)要大于瓶數(shù),,才能保證實(shí)驗(yàn)中的循環(huán)使用。



實(shí)驗(yàn)步驟


三.細(xì)胞培養(yǎng)用品的清洗與消毒滅菌
(1)清 洗

1.常用玻璃器皿清洗

◇清洗要領(lǐng)

浸泡

初次使用的玻璃器皿呈堿性,,表面常附有灰塵和一些對細(xì)胞有毒的物質(zhì),,如鋁和砷等??諝鉂穸雀邥r(shí),,玻璃器皿表面又易長霉。使用前,,新器皿浸泡在5%稀鹽酸中過夜,,以中和玻璃表面的堿性物質(zhì)并去除霉斑;然后經(jīng)簡單刷洗,,流水沖洗(逐片進(jìn)行),,蒸餾水浸泡,干燥備用,。新玻片處理后,短時(shí)間不用時(shí),,需將它投入95%的酒精中保存,,以防玻片長霉。培養(yǎng)后的玻璃器皿應(yīng)立即投入清水中浸泡,,器皿中殘留的細(xì)胞,、蛋白質(zhì)一旦干涸,即固著于玻璃表面,極難脫落,。

刷洗

用過的玻璃器材經(jīng)自來水沖洗后,,浸入水中煮沸,然后將適量洗滌劑(洗潔精或洗衣粉)投入沸水中繼續(xù)煮沸10分鐘,,趁熱刷洗器皿內(nèi)外,,刷洗后浸入清水中進(jìn)行沖洗。

酸泡

刷洗好的玻璃器材干燥后置清潔液中浸泡24小時(shí),,清潔液的強(qiáng)氧化作用可清除刷洗不掉的極微量雜質(zhì),。

◇清洗步驟

玻璃器材煮沸10分鐘→刷洗→流水振蕩沖洗15-20遍→50℃烤干→清潔液浸泡24小時(shí)→流水振蕩后沖洗15-20遍→漓水→蒸餾水浸泡2次(每次24小時(shí))→50℃烤干,待包裝,。

◇清洗注意事項(xiàng)和要求

①使用后的實(shí)驗(yàn)器材應(yīng)立即投入清水中,。

②浸泡、煮沸,、酸泡的器皿內(nèi)要充滿液體,,不得有氣泡。

③刷洗,、酸泡后的器材要用流水振蕩沖洗,,不得殘留洗滌劑、清潔液,。方法是:每瓶灌2/3容積的自來水,,振蕩后倒掉,重復(fù)15―20次(尖滴管置量杯中沖洗),。

④煮沸前的水面要高于器材5厘米,,水沸后投入洗滌劑(直徑35厘米的鋁鍋,用洗衣粉10克左右),。若洗滌劑和實(shí)驗(yàn)器材同時(shí)從冷水煮至沸騰或使用過量洗劑,,均易腐蝕玻璃表面,使玻璃堿化,,pH值上升,。

⑤軟毛刷的刷端已掉毛的應(yīng)該棄去,否則會損害玻璃,。玻璃劃痕處易殘留洗滌劑,,會改變培養(yǎng)液pH值和毒害細(xì)胞。

⑥清潔物品應(yīng)及時(shí)包裝消毒,,應(yīng)注意妥善保存,,防止落入灰塵、蟑螂,、螞蟻等引起二次污染,。

⑦使用后的膠塞與玻璃器材同時(shí)煮洗時(shí),膠塞要放在煮鍋的底部。

⑧浸泡器材的蒸餾水容器要專用,,并做好標(biāo)記,,如“蒸餾水Ⅰ盆"、“蒸餾水Ⅱ盆",。

⑨器材清洗干燥后,,在以后各步操作時(shí),手指不可接觸器材的使用端,。清洗者可戴一次性薄膜手套進(jìn)行操作,,省時(shí)又保證清洗質(zhì)量。

⑩用超聲波儀清洗器材時(shí),,清洗要求同上,。

2.橡膠制品的清洗

新購置的橡膠制品(膠塞、膠管,、橡皮乳頭)的洗滌方法如下:0.5摩爾/升NaOH煮沸15分鐘→流水沖洗→0.5摩爾/升HCl煮沸15分鐘→流水沖洗→自來水煮沸2次→蒸餾水煮沸20分鐘→50℃烤干備用,。這樣處理可*除凈膠塞上的硫磺等有毒物質(zhì)。用過的膠塞,,其清洗方法,、要求基本同玻璃器材。因膠塞使用面常沾有洗滌劑,,流水沖不凈,,故膠塞洗刷的重點(diǎn)部位是膠塞使用面,用刷逐個(gè)刷洗,。在使用過程中,,膠塞不能與培養(yǎng)液接觸,以防未洗凈的膠塞污染培養(yǎng)液和細(xì)胞,。

3.G6除菌濾器的清洗

新G6除菌濾器置玻璃洗液中浸泡24小時(shí),,流水緩慢沖洗,至pH值為5.5左右,,然后用4倍的蒸餾水緩慢沖洗,,再用重蒸餾水緩慢沖洗,烤干,,包裝消毒備用,。用過的G6除菌漏斗立即浸泡水中(注意:濾器千萬不能干涸)過夜,流水緩慢沖洗24小時(shí)或更長時(shí)間,,至濾面基本疏通時(shí),,50℃烤干,濾器再置清潔液中浸泡24小時(shí),,或裝滿清潔液自然過濾。流水沖洗及其后的處理同新G6除菌濾器。

4.正壓除菌濾器的清洗

新的或使用后的正壓濾器經(jīng)稀洗滌劑刷洗一次流水沖洗15分鐘→漓水→去離子水浸泡24小時(shí)→三蒸水浸泡24小時(shí)→干燥備用,。

5.塑料制品的清洗

塑料制品質(zhì)地軟且耐腐蝕能力強(qiáng),,但不耐熱,易出現(xiàn)劃痕,。其清洗程序?yàn)椋浩髅笥煤罅⒓从昧魉疀_洗→浸于自來水中過夜→用紗布,、棉簽和50℃稀洗液刷洗→流水沖洗(人工沖洗15―20遍)→晾干→浸于清潔液中15分鐘→流水沖洗→蒸餾水浸泡兩次(每次24小時(shí))→晾干備用。

6.清洗液的配制

清潔液

新配制的清潔液為棕紅色,,遇有機(jī)溶劑或水分增多時(shí)變成綠色,,表明失效。

先在搪瓷盆中加入蒸餾水,,加熱溶解重鉻酸鉀,,再將盆置流 動自來水中,待重鉻酸鉀液冷卻后,,緩慢加入濃硫酸,,邊加邊用玻棒攪動,以混合液溫度不過快上升和不出現(xiàn)重鉻酸鉀結(jié)晶為度,。

玻璃濾器洗液

取10克硝酸鈉和28.6毫升濃硫酸,,放入盛有470毫升蒸餾水的玻璃缸內(nèi)混勻備用。


清潔液配方


配方成分
常用方
弱液
次強(qiáng)液
強(qiáng)液
重鉻酸鉀(g)
100
50
100
60
清水(ml)
800
1000
1000
200
濃硫酸(ml)
200
90
160
800
硫酸濃度(v/v)
20%
8%
14%
80%
(2)消毒滅菌

1.濕熱消毒

◇濕熱消毒的要求

使用壓力蒸汽滅菌器進(jìn)行濕熱消毒,。

①消毒物品不能裝得太滿,,物品之間應(yīng)留有空隙,以利于消毒器內(nèi)蒸汽的流動,。

②排氣管要插入消毒器的槽內(nèi),。若排氣管斷裂,要將排氣管與排氣閥調(diào)至同一位置,。

③玻璃器材使用端(管口,、瓶口)要向下放置。

④液體消毒時(shí),,用棉塞或插有針頭的膠塞封瓶口,。

⑤加熱前將放氣閥摘子置垂直位(開放),消毒器內(nèi)空氣隨溫度升高由此閥孔逸出,,容器內(nèi)冷空氣隨之排出,。當(dāng)水煮沸時(shí),有一股較急的蒸汽沖出時(shí),,將放氣閥摘子置水平位(關(guān)閉),。排除冷空氣的另一種方法是:放氣閥摘子置水平位(關(guān)閉),加熱,,壓力升至5磅時(shí),,將摘子置垂直位(開放),,冷、熱空氣先后排出(可用手試),。待壓力指針回歸零位時(shí),,放氣閥摘子再置水平位(關(guān)閉)。

⑥繼續(xù)加熱,,當(dāng)消毒器內(nèi)升壓至需要壓力時(shí),,計(jì)時(shí)并使壓力恒定。壓力維持方法:用電加熱時(shí),,可通過電源和滅菌器間的穩(wěn)壓器調(diào)節(jié),;沒有穩(wěn)壓器時(shí),用放氣閥摘子自動排氣調(diào)節(jié),;用煤氣加熱時(shí),,可調(diào)節(jié)火力維持壓力。根據(jù)消毒物品種類不同所選擇的消毒壓力和時(shí)間也不同,,一般物品(如布類,、金屬器械、玻璃器皿等)消毒的要求是15磅20分鐘,;橡膠制品為10磅10分鐘,;常規(guī)液體消毒15磅15分鐘。一般認(rèn)為在這種壓力下1分鐘內(nèi)幾乎可殺死所有微生物,,但由于消毒物品的包裝內(nèi)仍可能留有冷空氣,,而使高壓蒸汽不能達(dá)到消毒器的各部分,所以要延長消毒時(shí)間,。

⑦消毒完畢,,待壓力指針降至零位,再等數(shù)分鐘,,待放氣閥摘子放完氣后打開消毒器蓋,。液體瓶口棉塞換膠皮塞或拔去膠皮塞針頭換新塞。



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