簡(jiǎn)介
一,、目的
MDCK細(xì)胞培養(yǎng)是分離流感病毒及相關(guān)研究實(shí)驗(yàn)的基本技術(shù),。疾控中心的所有技術(shù)人員,，必須按照本文件相關(guān)的操作規(guī)程進(jìn)行操作,。
二,、適用范圍
適用于疾控中心所有技術(shù)人員 ,。
三、程序
（一）生物安全要求
實(shí)驗(yàn)室生物安全級(jí)別：BSL-1
所有操作必須在BSL-1實(shí)驗(yàn)室的生物安全柜里進(jìn)行,。
材料與儀器
二）材料
1. 生長(zhǎng)成片的MDCK細(xì)胞
2. 無(wú)菌的T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶
3. D-MEM培養(yǎng)液（含有L-谷氨酰胺）
4. 青,、鏈霉素母液（10000 U/mL青霉素G；10000µg/mL硫酸鏈霉素）,，分裝后保存于-20℃
5. HEPES緩沖液,，1M母液
6. 胎牛血清
7. EDTA -胰酶（0.05%胰酶，0.53mMEDTA-4Na），分裝后保存于-20℃
8. 7.5%牛血清白蛋白組分V
9. 1mL,、10mL無(wú)菌移液管
10. 70％～75％的酒精
注意事項(xiàng)：經(jīng)常檢查試劑使用的有效期,。
實(shí)驗(yàn)步驟
（三）實(shí)驗(yàn)步驟
這里以T75細(xì)胞瓶的單層細(xì)胞培養(yǎng)為例，敘述MDCK細(xì)胞的培養(yǎng)程序,。如果細(xì)胞瓶的規(guī)格有變,，MDCK細(xì)胞懸液的量必須做相應(yīng)的調(diào)整。
1. D-MEM培養(yǎng)液的準(zhǔn)備
500mL D-MEM液中加入：
青,、鏈霉素母液5mL（終濃度達(dá)：100U/mL青霉素,；100µg/mL鏈霉素），
HEPES緩沖液12.5mL（終濃度：25mM）,。
7.5%牛血清白蛋白組分Ⅴ 12.5mL
2. 細(xì)胞生長(zhǎng)液的準(zhǔn)備
胎牛血清10mL加到90mL的上述（1）的液體中,，使胎牛血清的終濃度為10%。
3. 首先將細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液棄去,，加入5mL在37℃水浴中預(yù)熱的EDTA-胰酶,。
4. 溫和地?fù)u動(dòng)細(xì)胞瓶1min，使EDTA-胰酶均勻分布在整個(gè)細(xì)胞薄層,。然后用移液管吸去EDTA胰酶,。
5. 重新加入5mL在37℃水浴中預(yù)熱的EDTA-胰酶重復(fù)上述步驟。
6. 加入1mLEDTA-胰酶使其均勻分布在整個(gè)細(xì)胞薄層,，37℃孵育細(xì)胞瓶直至細(xì)胞從塑料細(xì)胞瓶的表面分離（約5～10min）,。必要時(shí)可以搖動(dòng)或吹打來(lái)分離細(xì)胞。然后加入1mL胎牛血清滅活殘余的胰酶,。
7. 加9mL已經(jīng)配置好的含有L-谷氨酸的D-MEM培養(yǎng)液,，輕輕用移動(dòng)移液管來(lái)吹散細(xì)胞團(tuán)。
8. 取10mL混合物加到90mL細(xì)胞生長(zhǎng)液（細(xì)胞懸液的濃度大約為每毫升含105細(xì)胞）
9. 每個(gè)T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶加入6mL（6×105/mL）細(xì)胞懸液,，剩余的細(xì)胞懸液可以加到T75細(xì)胞瓶用于細(xì)胞傳代,。通常6mL細(xì)胞懸液2～3日可生長(zhǎng)成片（80％～90％）的單層細(xì)胞。
10. 于37℃,，5%CO2培養(yǎng)箱里培養(yǎng)細(xì)胞,，每天觀察細(xì)胞狀態(tài)，以供進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)用,。
