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常有用戶提到細(xì)胞狀態(tài)不好,,
比如:細(xì)胞不再透亮,內(nèi)部有很多細(xì)碎的小黑點(diǎn),,細(xì)胞形態(tài)異常,,培養(yǎng)液變黃……
這時(shí),除了考慮細(xì)菌污染的問題,,細(xì)胞老化也不容忽視~
何為細(xì)胞老化,?
1882年,德國(guó)生物學(xué)家Weismann曾大膽預(yù)測(cè)“在細(xì)胞水平存在老化現(xiàn)象",。他推測(cè):機(jī)體的壽命限制受控于體細(xì)胞的分裂能力,;在遺傳進(jìn)化中,不同物種的體細(xì)胞獲得了不同分裂的潛能,,從而決定了不同物種的壽命長(zhǎng)短,。
20世紀(jì)50年代,Swin和他的同事利用原代細(xì)胞體外培養(yǎng)試驗(yàn)證明了來(lái)源于不同物種的纖維細(xì)胞均不具備無(wú)限分裂的潛能,。取得突破性進(jìn)展的還是Hayflick和Moorhead,,他們做了更系統(tǒng)更細(xì)致的觀察和描述,他們對(duì)25株人成纖維細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng),,在這個(gè)過程中發(fā)現(xiàn),,經(jīng)過約50次傳代之后,所有細(xì)胞出現(xiàn)功能退化,,并且喪失分裂能力的現(xiàn)象,。此后人們將這一現(xiàn)象稱之為“Hayflick極限"或者自發(fā)性老化。之后也有事實(shí)證明,,細(xì)胞老化并不是體外培養(yǎng)所導(dǎo)致,,細(xì)胞在體內(nèi)也會(huì)隨著年齡的增長(zhǎng),逐步走向老化,。
長(zhǎng)期的細(xì)胞周期阻滯是老化細(xì)胞的基本特征,也是體外鑒定細(xì)胞老化*的指標(biāo)。為了檢查細(xì)胞是否躍出了細(xì)胞周期,,人們通常檢測(cè)增殖指示分子Ki-67的表達(dá)豐度,;或者通過將與胸腺嘧啶相似的溴脫氧尿嘧啶(Bromodeoxyuridine,BrdU)摻入到細(xì)胞培養(yǎng)基中,,觀察是否有新的DNA合成,。細(xì)胞老化主要表現(xiàn)為G1期阻滯,個(gè)別情況下也可伴隨G2/M期周期阻滯,,或直接由G2/M期阻滯誘發(fā)形成,。
雖然由于細(xì)胞周期的中斷和DNA復(fù)制的停止,老化細(xì)胞內(nèi)的DNA含量與正常細(xì)胞類似,,但 RNA與蛋白質(zhì)豐度均比正常細(xì)胞要明顯升高,。這是因?yàn)椋M管細(xì)胞進(jìn)入老化階段后蛋白質(zhì)的整體合成速率降低,,但是蛋白質(zhì)的降解體系受到更加明顯的抑制,,導(dǎo)致蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)持續(xù)堆積。
無(wú)論是原代細(xì)胞或是細(xì)胞株,,在細(xì)胞培養(yǎng)過程中細(xì)胞老化現(xiàn)象是存在且常見的,但卻容易被操作人員忽略,,老化的細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)的特征包括:細(xì)胞增殖變慢,、細(xì)胞核體積異常及多核(4-8核)、表面分泌物增多,、細(xì)胞體積增大,、細(xì)胞扁平、細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)空泡等現(xiàn)象,。
細(xì)胞老化最開始的現(xiàn)象通常為細(xì)胞內(nèi)部會(huì)出現(xiàn)空泡(可能是凋亡小體),,也可能會(huì)出現(xiàn)黑點(diǎn),大多沿細(xì)胞周邊排布,,內(nèi)部中間也可能會(huì)顯現(xiàn)一些,,但相對(duì)周邊較少;
老化的細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞體積增大,,胞質(zhì)濃縮,,胞膜起泡,皺縮等現(xiàn)象,;
老化以后的細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)立體感慢慢消失,,開始成扁平狀,細(xì)胞與細(xì)胞之間的間隔減小或混在一起,;
細(xì)胞折光性變差,,鏡下可見細(xì)胞“變薄",做轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)時(shí),細(xì)胞死亡率會(huì)較高,,但培養(yǎng)液不會(huì)發(fā)生迅速變黃的現(xiàn)象,,仍清亮。(如果是細(xì)菌污染的話,,一般會(huì)出現(xiàn)培養(yǎng)液的迅速變黃,,混濁,鏡下可見大量繁殖的細(xì)菌,;若是支原體污染的話,,細(xì)胞也會(huì)失去正常形態(tài),也有細(xì)胞會(huì)死亡),;
細(xì)胞的貼壁性減弱,,開始有細(xì)胞漂浮在培養(yǎng)液中;
老化的細(xì)胞表面分泌物會(huì)增多,,細(xì)胞表面的純凈度越來(lái)越低,;
分裂的細(xì)胞數(shù)量明顯的減少,同時(shí)細(xì)胞的增殖速度也會(huì)大大下降,;
細(xì)胞開始長(zhǎng)角分化,。
如下圖:
圖1. HEK293細(xì)胞
圖2. MSC細(xì)胞
圖1 實(shí)心箭頭指示的是發(fā)生細(xì)胞老化的HEK293細(xì)胞,,SA-β-gal染色陽(yáng)性,,而空心箭頭指的是未發(fā)生老化的細(xì)胞。
圖2 被染上藍(lán)色的是發(fā)生老化的MSC細(xì)胞, 未被染色的是未發(fā)生老化的細(xì)胞,。
由圖片可以看出老化細(xì)胞體積增大,、細(xì)胞扁平。
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