一個小細胞可能會把人弄得吃不下,，睡不著,，焦頭爛額？,？？信不信還真的有這樣的事情 ,，可能整個實驗下來計劃是三個月左右,，但實際有時候出手的第一步就遇到了攔路虎，why,？細胞總是養(yǎng)不好,；天啊，馬上就到了三個月了,，SO sad,，下面我們就來看看細胞主要的培養(yǎng)步驟吧。

選對培養(yǎng)基很重要：

培養(yǎng)某一類型細胞沒有固定的培養(yǎng)條件,。在MEM中培養(yǎng)的細胞,，很可能在DMEM或M199中同樣很容易生長,。總之,，一般首先選MEM做粘附細胞培養(yǎng),、RPMI-1640做懸浮細胞培養(yǎng)是一個好的開始，各種目的無血清培養(yǎng)最好首先選的培養(yǎng)基,。 

GlutaMAX-I是什么,？培養(yǎng)細胞如何利用GlutaMAX-I？這個二肽有多穩(wěn)定,？

GlutaMAX-I 二肽是一個L-谷氨酰胺的衍生物,，其不穩(wěn)定的alpha-氨基用L-丙氨酸來保護。一種肽酶逐漸裂解二肽,，釋放L-谷氨酰胺供利用,。GlutaMAX-I二肽非常穩(wěn)定，即使在121磅滅菌20分鐘,，GlutaMAX-I 二肽溶液有最小的降解,，如果在相同條件下，L-谷氨酰胺幾乎*降解,。

酚紅在培養(yǎng)基中被用來作為PH值的指示劑：中性時為紅色,，酸性時為黃色，堿性時為紫色,。研究表明,，酚紅可以模擬固醇類激素的作用，（特別是雌激素）,。為避免固醇類反應,，培養(yǎng)細胞，尤其是哺乳類細胞時,，用不加酚紅的培養(yǎng)基,。由于酚紅干擾檢測，一些研究人員在做流式細胞檢測時,，不使用加有酚紅的培養(yǎng)基,。

培養(yǎng)基中丙酮酸鈉的作用是什么？

丙酮酸鈉可以作為細胞培養(yǎng)中的替代碳源,，盡管細胞更傾向于以葡萄糖作為碳源,，但是，如果沒有葡萄糖的話,，細胞也可以代謝丙酮酸鈉,。 

一旦您在新鮮培養(yǎng)基中添加了血清和抗生素時，您應該在兩到三周內使用它,。因為一些抗生素和血清中的基本成分在解凍后就開始降解,。 

大部分添加物和試劑最多可以凍融3次,，如果次數(shù)更多都會在包含蛋白的溶液引起一定水平的降解和沉淀，將會影響它的性能,。這個特別在血清上體現(xiàn)的很明顯,，有些血清沉淀特別多，客服都會告訴您這個是血清的析出蛋白,，讓您不要離心直接使用也是這個原理 ,，因為離心之后您的血清連那么點營養(yǎng)蛋白都沒有啦 

38 在溶解的一周內使用貯存在4℃冰箱中的液體胰蛋白酶溶液。胰蛋白酶在4℃就可能開始降解,，如果在室溫下放置超過30分鐘,，就會變得不穩(wěn)定 

同時細胞的狀態(tài)也非常重要，有些老師認為,，腫瘤細胞反正可以無限傳代,，那么我就用之前傳過188代的細胞來做實驗又如何，要是細胞的形態(tài)好,，可能真的沒有什么問題,，但是若細胞形態(tài)也不行，那要考慮是否用這個細胞了 ,，一般細胞的形態(tài)不好涉及到三個方面：1.培養(yǎng)基使用的不對嚴重改變細胞的營養(yǎng)環(huán)境,，細胞為自救不得不變異以求生長；2.操作手法不對,，造成細胞污染等,，3.傳代次數(shù)太多，因為每次傳代都會給細胞造成輕微的損傷,，導致細胞在傳代之后不斷的修復,，修復的細胞需要的衍生物，比如血清,，培養(yǎng)基,，可能會根據(jù)配方和批次的不同，給細胞造成不同程度的變異,。

So easy的操作手法：

第一見細胞的時候,，都不知道從何入手，太嬌貴了 ,，怎么辦？其實,，我們只要記住一點就可以了：無菌操作,，無菌操作，無菌操作,，重要的事情說三遍,，之后我們就可以放開手腳,，大干一場了。 

Step 1 ： 冷凍管應如何解凍,？

取出冷凍管后,，須立即放入37 C水槽中快速解凍，輕搖冷凍管使其在1分鐘內全部融化,，并注意水面不可超過冷凍管蓋沿,，否則易發(fā)生污染情形。另冷凍管由液氮桶中取出解凍時,，必須注意安全,，預防冷凍管之爆裂。注意：復蘇不一定要離心,，除少數(shù)特別注明對DMSO敏感之細胞外,，絕大部分細胞株（包括懸浮性細胞），在解凍之后,，應直接放入含有10-15ml新鮮培養(yǎng)基之培養(yǎng)瓶中,，待隔天再置換新鮮培養(yǎng)基以去除DMSO 即可。

如此可避免大部分解凍后細胞無法生長或貼附之問題,。 

Step 2:怎么培養(yǎng),？

培養(yǎng)關鍵點還在傳代操作，一想到傳代,，天啊 ,，會不會很復雜？首先我們要等到細胞到達80%-85%的密度再進行操作,，為什么是這個密度,？因為這個密度剛好是細胞生長的鼎盛期，因為細胞和細胞間都會有信號通路互相聯(lián)系,，這個時候他們都共同商量好了要努力生長,，然后傳代之后，他們看到空間還是這么大,，就會把努力生長的精神一直傳承下去,，直到他們過了生長鼎盛期到生長平頂期為止。當然有些貪婪的聚集成簇生長的細胞,，他們會不辭辛苦,，日以繼日的生長，直到培養(yǎng)基不能給他們提供一點養(yǎng)分為止,。 

Step 3:不可忽略的重要的傳代過程：

1.37度水浴加熱*培養(yǎng)基,，0.25% 胰蛋白酶/EDTA溶液，我們不建議在37度溫度下加熱試劑和培養(yǎng)基,，水浴優(yōu)先使用,。

2. 用DPBS沖洗細胞,，并倒掉洗過的DPBS。

3. 加入1 ml 0.25% T/E溶液裝入T-25瓶中,。輕輕搖動燒瓶,，以確保T/E溶液*覆蓋細胞。用顯微鏡觀察細胞形態(tài)的變化,。

4.,。在孵育期間，準備一個15毫升的錐形離心管與5ml胰酶中止液

5.在消化時,，輕輕敲打培養(yǎng)瓶的側面,，將細胞從表面剝離出來。在顯微鏡下檢查,，確保所有的細胞間隙變大并且都開始呈流沙狀脫落,。

6.. 向培養(yǎng)瓶中加入5 ml胰酶中止液，將分離的細胞轉移到15ml離心管中,。用另外5 mll胰酶中止液清洗培養(yǎng)瓶以收集殘留的細胞,。

7.將15毫升離心管以1000 rpm離心5分鐘，收集消化好的細胞沉淀,。

8.將細胞沉淀分別滴入我們要分瓶的容器里,，完成傳代。