1.制膠：

先制分離膠,，再制濃縮膠,，嚴(yán)格按照制膠說明書來就可以了。需要注意的一點是制膠一定要混勻,！混勻,！混勻！個人經(jīng)驗是每加一種試劑,，就混勻一下,，直到最后一種試劑加完。 

對于初學(xué)者,，還要區(qū)分制膠的玻璃板是 1.0cm 還是 1.5cm 的,，兩者需要的制膠液體量是不一樣的。另外,，玻璃板一定要洗干凈,，本人平時都是用洗潔精洗干凈然后用水沖洗最后用純水沖洗，再放在烤箱里烤干并晾至室溫,。 

2.點樣：

點樣的過程很簡單,，表手抖就 OK 了。再者,，點樣的過程一定迅速,，不然前面的樣容易彌散，雖說不至于太影響結(jié)果,，但對于有強(qiáng)迫癥的同學(xué)來說還是比較致命的傷害,。 

3.跑膠：

注意，跑膠時也會出現(xiàn)各種烏龍,，如果跑了好大一會兒還不見條帶下移,，請看一下你的玻璃板是否放反；如果跑膠時發(fā)現(xiàn)溫度過高,，可檢查一下正負(fù)極是否連接反了,。跑膠建議恒壓,，80V 30min， 120V 60min（這個得具體看目的條帶的 位置,，時間可相應(yīng)增減） 

4.轉(zhuǎn)膜：

請牢記轉(zhuǎn)膜順序（黑色面-濾紙-海綿-膠-膜-海綿-濾紙-白色面）,，如若搞不清楚，可想象一下,，蛋白質(zhì)是帶負(fù)電荷的,，應(yīng)該是往正極方面跑，所以膜應(yīng)該放在正極面,。轉(zhuǎn)膜時要恒流,， 285mA—300mA 60min。特別注意的是跑膠時恒壓,，轉(zhuǎn)膜時恒流這個條件,。 

5.封閉特異性抗原：

封閉和孵育抗體也是非常關(guān)鍵的步驟，封閉建議大家用 5%的脫脂奶粉,， 2 個小時（或者過夜）,，不建議用 BSA。 

6.一抗孵育：

封閉完以后不用洗直接孵育一抗,，一抗配置溶液是 3% BSA 的 TBST（注意封閉和抗體孵育用的蛋白,，封閉用牛奶，抗體孵育用 BSA,，這個條件是決定條帶是否齊整及有無雜帶的關(guān)鍵）,，過夜（或 2 個小時）。時間上與封閉錯開,，如若封閉過夜,，則一抗只需要兩個小時。 

7.二抗孵育：

洗三遍后孵育二抗 1 小時,，洗的時間很重要，習(xí)慣是洗三遍,，第一二三次分別是 5min,、10min、15min,。還要特別強(qiáng)調(diào)的是,，孵育和洗膜用的轉(zhuǎn)速是不一樣的。孵育是低速,，使膜和抗體有充分的接觸時間,；洗膜時要用高速，以使膜洗得干凈,。還有,，一抗孵育時正面朝下，封閉和二抗孵育時都是朝上。（表問為什么,，不知道,，經(jīng)驗之談） 

8.曝光：

當(dāng)滿足了所有以上的實驗條件之后，你就可以自信滿滿地去曝光了,。相信我,，不管是磷酸化的還是普通的蛋白，都會出現(xiàn)平整光滑的條帶,。

最后說一下配置實驗所需的各種溶液：TBST 可以買,，也可以自己配置；同時 TBST 可以用 PBST 代替,，即 PBS 加吐溫就可以了,。封閉和抗體孵育時所用的 5%的脫脂奶粉和 3%的 BSA 都是用 TBST 配置。洗膜時用 TBST 和 PBST,，這個就不用說了吧,。