1.制膠：

先制分離膠,，再制濃縮膠，嚴格按照制膠說明書來就可以了,。需要注意的一點是制膠一定要混勻,！混勻,！混勻,！個人經(jīng)驗是每加一種試劑，就混勻一下,，直到最后一種試劑加完,。 

對于初學者，還要區(qū)分制膠的玻璃板是 1.0cm 還是 1.5cm 的,，兩者需要的制膠液體量是不一樣的,。另外，玻璃板一定要洗干凈,，本人平時都是用洗潔精洗干凈然后用水沖洗最后用純水沖洗,，再放在烤箱里烤干并晾至室溫。 

2.點樣：

點樣的過程很簡單,，表手抖就 OK 了,。再者，點樣的過程一定迅速,，不然前面的樣容易彌散,，雖說不至于太影響結果，但對于有強迫癥的同學來說還是比較致命的傷害,。 

3.跑膠：

注意,，跑膠時也會出現(xiàn)各種烏龍，如果跑了好大一會兒還不見條帶下移,，請看一下你的玻璃板是否放反,；如果跑膠時發(fā)現(xiàn)溫度過高，可檢查一下正負極是否連接反了,。跑膠建議恒壓,，80V 30min， 120V 60min（這個得具體看目的條帶的 位置，時間可相應增減） 

4.轉膜：

請牢記轉膜順序（黑色面-濾紙-海綿-膠-膜-海綿-濾紙-白色面）,，如若搞不清楚,，可想象一下，蛋白質是帶負電荷的,，應該是往正極方面跑,，所以膜應該放在正極面。轉膜時要恒流,， 285mA—300mA 60min,。特別注意的是跑膠時恒壓，轉膜時恒流這個條件,。 

5.封閉特異性抗原：

封閉和孵育抗體也是非常關鍵的步驟,，封閉建議大家用 5%的脫脂奶粉， 2 個小時（或者過夜）,，不建議用 BSA,。 

6.一抗孵育：

封閉完以后不用洗直接孵育一抗，一抗配置溶液是 3% BSA 的 TBST（注意封閉和抗體孵育用的蛋白,，封閉用牛奶,，抗體孵育用 BSA，這個條件是決定條帶是否齊整及有無雜帶的關鍵）,，過夜（或 2 個小時）,。時間上與封閉錯開，如若封閉過夜,，則一抗只需要兩個小時,。 

7.二抗孵育：

洗三遍后孵育二抗 1 小時，洗的時間很重要,，習慣是洗三遍,，第一二三次分別是 5min、10min,、15min,。還要特別強調的是，孵育和洗膜用的轉速是不一樣的,。孵育是低速,，使膜和抗體有充分的接觸時間；洗膜時要用高速,，以使膜洗得干凈,。還有，一抗孵育時正面朝下,，封閉和二抗孵育時都是朝上,。（表問為什么，不知道，經(jīng)驗之談） 

8.曝光：

當滿足了所有以上的實驗條件之后,，你就可以自信滿滿地去曝光了,。相信我，不管是磷酸化的還是普通的蛋白,，都會出現(xiàn)平整光滑的條帶,。

最后說一下配置實驗所需的各種溶液：TBST 可以買，也可以自己配置,；同時 TBST 可以用 PBST 代替,，即 PBS 加吐溫就可以了。封閉和抗體孵育時所用的 5%的脫脂奶粉和 3%的 BSA 都是用 TBST 配置,。洗膜時用 TBST 和 PBST,，這個就不用說了吧。