做過 Western-Blot 的童鞋知道,，分子量小于 30KDa 的蛋白分子不容易做。小分子蛋白虐我千百遍,，我待小分子蛋白如初戀。抱怨是沒用的,，想方設(shè)法解決問題才是正道。一次又一次的調(diào)整方案,，一次又一次的徒勞無功。在此,，總結(jié)了小分子蛋白之路經(jīng)驗,，供有需求的童鞋參考,。

一、提蛋白的過程在 30 分鐘之內(nèi)完成,，提完蛋白立即加入上樣緩沖液煮沸（煮沸的時間長一點，一般 20 分鐘）,，準(zhǔn)備好蛋白樣品后立即電泳,。（小分子蛋白容易形成多聚體,，這樣可以大大減少多聚體的形成）,。

二,、電泳時，電泳的時間要足夠長,。習(xí)慣是先用 60-80V 電壓跑完濃縮膠,，再以 100-120V 電壓跑分離膠，溴酚藍(lán)電泳至玻璃板底部,。伯樂系列的電泳槽一般電泳 2 個小時左右，GE 以及百晶系列的電泳槽要電泳 4 到 5 個小時,。電泳時要在冰水浴中進(jìn)行,。最好用 1mm 和 1.5mm 厚的膠（若用 0.75mm 厚的膠時要適當(dāng)縮短轉(zhuǎn)膜時間）,。

三,、轉(zhuǎn)膜時，盡量用濕轉(zhuǎn)法（半干轉(zhuǎn)也可以,，但是容易轉(zhuǎn)過）,。轉(zhuǎn)膜緩沖液中,，甲醇濃度要達(dá)到 20%。PVDF 膜,，財大氣粗的土豪可以用 0.22 微米的膜,。對于我們大多數(shù)窮人來說，0.45 微米的膜也是可以的,。以下是摸索出來的轉(zhuǎn)膜時間（濕轉(zhuǎn)法,，0.45 微米的膜），供大家參考,。

四,、一抗孵育因為多數(shù)小分子蛋白的表達(dá)量較少，所以我一般孵育至少 48 個小時,，甚至孵育 72 個小時,。以上方法適用于分子量在 20-30KDa 的蛋白。若蛋白分子量小于 15KDa,，則不用 SDS-PAGE 凝 膠電泳（蛋白與 SDS 共遷移,，影響分離度，得不到很好的分離效果）,，應(yīng)該采用 Tris-Tricine 緩沖系統(tǒng)與 Tricine 分離膠。具體操作步驟見《精編分子生物學(xué)實驗室指南》338-340 頁（這本書每個實驗室必會備,，若沒有，可以在孔夫子舊書市場上買一本）,。

需要注意的是，Tricine 電泳時,，蛋白樣品用 Tricine 樣品緩沖液處理，加樣前在 37-40℃沙浴中處理一個小時（不要煮沸,！不要煮沸！不要煮沸,！重要的事情說三遍）,。內(nèi)槽中加滿陰極緩沖液，外槽中加滿陽極緩沖液（千萬不要加反了,。否則蛋白全部進(jìn)入緩沖液?。?。 

最后,，祝做小分子蛋白的童鞋實驗之路順利，早日做出滿意的結(jié)果,。