抗體 

工欲善其事必先利其器，抗體很關鍵。這里我們要說的并不是最貴的就是好的,，如果條件允許，建議同時購買不同廠家的抗體,，一起來試一試,，因為有時候即使是好的品牌，不同批次穩(wěn)定性也不一樣,?？贵w從訂購到到貨有一定的時間，所以到貨后請盡快分裝好,，準備做實驗,，如果實驗進度跟不上的問題，導致抗體到了后拖了很久才正式實驗,，這樣拖了時間找廠家售后申訴也是很被動的,。用 CST 的一抗，效果不穩(wěn)定,，也可能跟抗體放久了有關。最后買了另一家代理的抗體算是有了比較穩(wěn)定的結果,。當然,，還是選擇購買口碑較好的公司的產品為佳，這樣即使出了問題售后也會跟進,。如果經費有限,，可以買買小包裝的產品先試試，不少抗體公司還有 5ul 的抗體試用裝免費申請,。再者,，孵育一抗的時候，建議用新鮮抗體,，什么意思呢,？很多同學因為想圖省事兒，很多時候配好孵育液,，每次孵育好之后再次放進冰箱等待下次重復利用,，一些比較好跑的蛋白到時沒啥問題，但是磷酸化的蛋白建議每次都用新鮮的抗體原液,，將條帶剪下來后用雜交袋塑封 好,，按 1：1000 的比例加入抗體原液孵育，再這種情況下，100ul 的抗體也是能用很久的,，所以盡量每次都用新的抗體,。

蛋白上樣 

普遍反映磷酸化的條帶很淡，有時候達不到制圖標準,，這點可以加大上樣量來解決,，另外，磷酸化蛋白一般與非磷酸化的蛋白一起跑一起制圖,，它本來就是要比非磷酸化的要淡一些,，不要過分擔心。 

電泳 

不同 kb 的蛋白電泳時間有所差別,，參數啥的要用腦子更改,，不能一成不變，避免發(fā)生那種蛋白跑不見了的慘劇,。 

封閉

這個步驟非常重要,，強推 BSA 封閉，不要用脫脂奶粉封閉,，BSA 封閉對磷酸化的抗體效果非常好,，而且也不貴。另外,，BSA 封閉液倒是可以反復使用不至于向奶粉一樣臭掉,，用來孵育一般非磷酸化的抗體，效果同樣棒棒噠,！ 再者,，封閉時間可以延長，一般封閉 2-3 小時的情況下,，可以封閉延時到 4 小時,，所以按照從早到晚做實驗的時間，用 BSA 配好封閉液開始封閉的時候,，您就可以慢慢的約個火鍋唱個歌再回來了,，實驗本來就很辛苦，不要再依賴外賣小哥了,。 

洗膜 

嚴格遵守洗膜時間,，不得減少次數，每個步驟洗 3 次,，每次可以洗長一點,，比如（11-12 分鐘）。