抗體 

工欲善其事必先利其器,，抗體很關(guān)鍵,。這里我們要說(shuō)的并不是最貴的就是好的，如果條件允許,，建議同時(shí)購(gòu)買不同廠家的抗體,，一起來(lái)試一試，因?yàn)橛袝r(shí)候即使是好的品牌,，不同批次穩(wěn)定性也不一樣,。抗體從訂購(gòu)到到貨有一定的時(shí)間,，所以到貨后請(qǐng)盡快分裝好,，準(zhǔn)備做實(shí)驗(yàn)，如果實(shí)驗(yàn)進(jìn)度跟不上的問(wèn)題,，導(dǎo)致抗體到了后拖了很久才正式實(shí)驗(yàn),，這樣拖了時(shí)間找廠家售后申訴也是很被動(dòng)的。用 CST 的一抗,，效果不穩(wěn)定,，也可能跟抗體放久了有關(guān)。最后買了另一家代理的抗體算是有了比較穩(wěn)定的結(jié)果,。當(dāng)然,，還是選擇購(gòu)買口碑較好的公司的產(chǎn)品為佳，這樣即使出了問(wèn)題售后也會(huì)跟進(jìn),。如果經(jīng)費(fèi)有限,，可以買買小包裝的產(chǎn)品先試試，不少抗體公司還有 5ul 的抗體試用裝免費(fèi)申請(qǐng),。再者,，孵育一抗的時(shí)候，建議用新鮮抗體,，什么意思呢,？很多同學(xué)因?yàn)橄雸D省事兒，很多時(shí)候配好孵育液,，每次孵育好之后再次放進(jìn)冰箱等待下次重復(fù)利用,，一些比較好跑的蛋白到時(shí)沒(méi)啥問(wèn)題，但是磷酸化的蛋白建議每次都用新鮮的抗體原液,，將條帶剪下來(lái)后用雜交袋塑封 好,，按 1：1000 的比例加入抗體原液孵育，再這種情況下，100ul 的抗體也是能用很久的,，所以盡量每次都用新的抗體,。

蛋白上樣 

普遍反映磷酸化的條帶很淡，有時(shí)候達(dá)不到制圖標(biāo)準(zhǔn),，這點(diǎn)可以加大上樣量來(lái)解決,，另外，磷酸化蛋白一般與非磷酸化的蛋白一起跑一起制圖,，它本來(lái)就是要比非磷酸化的要淡一些,，不要過(guò)分擔(dān)心。 

電泳 

不同 kb 的蛋白電泳時(shí)間有所差別,，參數(shù)啥的要用腦子更改,，不能一成不變，避免發(fā)生那種蛋白跑不見(jiàn)了的慘劇,。 

封閉

這個(gè)步驟非常重要,，強(qiáng)推 BSA 封閉，不要用脫脂奶粉封閉,，BSA 封閉對(duì)磷酸化的抗體效果非常好,，而且也不貴。另外,，BSA 封閉液倒是可以反復(fù)使用不至于向奶粉一樣臭掉,，用來(lái)孵育一般非磷酸化的抗體，效果同樣棒棒噠,！ 再者,，封閉時(shí)間可以延長(zhǎng)，一般封閉 2-3 小時(shí)的情況下,，可以封閉延時(shí)到 4 小時(shí),，所以按照從早到晚做實(shí)驗(yàn)的時(shí)間，用 BSA 配好封閉液開(kāi)始封閉的時(shí)候,，您就可以慢慢的約個(gè)火鍋唱個(gè)歌再回來(lái)了，實(shí)驗(yàn)本來(lái)就很辛苦,，不要再依賴外賣小哥了,。 

洗膜 

嚴(yán)格遵守洗膜時(shí)間，不得減少次數(shù),，每個(gè)步驟洗 3 次,，每次可以洗長(zhǎng)一點(diǎn)，比如（11-12 分鐘）,。