今天給大家分享一下在用磷酸化抗體做Western Blot時,，應(yīng)該注意些什么。

1.警惕內(nèi)部敵人

一定要在 lysis buffer 中加入蛋白酶抑制劑,，還要加入一定量的磷酸酶抑制劑,，因為組織或細(xì)胞裂解時會釋放出大量磷酸化蛋白的死對頭——內(nèi)源性蛋白磷酸酶，催化磷酸化蛋白(R-p)的去磷酸化,，導(dǎo)致不同于正常生理狀態(tài)的差異,。因此，外源性加入蛋白磷酸酶抑制劑,，抑制磷酸化蛋白的去磷酸化,，維護蛋白質(zhì)的磷酸化狀態(tài)，否則即使 band 壓出來也會很淺,，結(jié)果也不可信,。

2.低溫能讓他們緊緊地?fù)肀Ψ?/p>

加一抗后最好 4 度過夜，低溫能讓抗體和目的蛋白緊緊地?fù)肀Ψ?。為什么,？因為蛋白抗原在膜上靠的是物理吸附，高溫下容易脫落,。膜上的抗原脫落了，結(jié)合效率會低,。4 度也可使一抗重復(fù)使用多次,。畢竟磷酸化的抗體都挺貴的。（土豪隨意）磷酸化的蛋白只占總的蛋白量的極少部分,，就像聯(lián)誼舞會上讓來賓多相處一會產(chǎn)生 couple 的概率會大很多那樣,，過夜可以保證抗體和蛋白有充分的結(jié)合時間,。二抗則室溫 1 小時即可。

3.磷酸化抗體哪家強,？

當(dāng)然是 Cell signaling 公司,。他家做的磷酸化抗體不錯，尤其是 MAPKs 磷酸化抗體,。最好根據(jù)廠商的 protocol 來操作實驗,，這是實驗成功的保證。

4．他們不宜“喝奶"

建議用含 5%BSA 的 TBST 稀釋 phospho-p38 等抗體,，效果不錯,，而不是用常見的含 5%nonfat milk 的 TBST。因為脫脂奶含磷酸化蛋白豐富,，是奶中磷元素的來源之一,。

5.如何避免磷化蛋白君和總蛋白君在膜上“打架"？

研究完某一蛋白的磷酸化情況后一般也要研究一下該蛋白總的表達(dá)量,。但兩者的條帶位置一樣,，怎么做？可以這樣：壓完磷酸化抗體后,，把相同的 membrane 做 strip 后再壓總蛋白抗體,然后再 strip 一次,，再壓內(nèi)標(biāo) actin。

6.聽 marker 的,，沒錯

做磷酸化蛋白 WB 時,除了目標(biāo)蛋白的 band 以外,往往會出現(xiàn)非特異性的 band,。磷酸化抗體 不好的話,甚至?xí)撼龇翘禺愋缘?band,而沒有你想要的 band,所以壓片以后,一定要根據(jù) markers 比對一下,你壓出的 band 分子量是否正確。

7.洗滌也大有學(xué)問

洗滌對最后的背景影響也較大,，millipore 最近的說明書推薦用雙蒸水洗滌,，效果很明顯，具體可以這樣：1st and 2nd 抗體之間,，DDW 5min X3 次,，2nd 抗體后，DDW 5min X3 次,，TBST  5min X1 次,，DDW rinse 3-4 次。對比 TBST 洗滌的 membrane,，效果有一定差距,，背景有效降低，即使壓片 30min,，背景仍然是可以忽略的,。