CO-IP 并不容易做，尤其是兩個(gè)蛋白豐度低,，相互作用力較弱的時(shí)候,。做 CO-IP 經(jīng)常會(huì)遇到?jīng)]有條帶的問題。這里談?wù)?CO-IP 沒有條帶的常見原因和解決的辦法,，更有獨(dú)門配方獻(xiàn)上,。

蛋白濃度過稀 

絕大多數(shù)情況下，CO-IP 沒有條帶是由于蛋白濃度過稀,。裂解產(chǎn)物的蛋白濃度越高越好,。但是,，有些實(shí)驗(yàn)室喜歡稀釋裂解樣品的蛋白濃度再做 CO-IP。其實(shí),，在大多數(shù)情況下要盡可能避免稀釋你的細(xì)胞裂解液,。盡量使細(xì)胞裂解產(chǎn)物的蛋白濃度可達(dá) 7-8 mg/ml 左右。這才會(huì)避免發(fā)生沒有條帶的情況,。

沒有裂解開 

很多時(shí)候,，由于裂解液不夠強(qiáng)烈，蛋白質(zhì)復(fù)合物沒有分開,，也會(huì)造成沒有條帶的問題,。解決辦法是：加溫和加少量的 SDS 增加變性能力。這里再介紹一個(gè)小竅門：最初幾遍的漂洗 buffer 要和 IP 時(shí)的鹽濃度相同,。純化蛋白的時(shí)候,，如果用低鹽裂解細(xì)胞，高鹽漂洗去雜質(zhì),，蛋白丟失較多,。再奉獻(xiàn)一個(gè)獨(dú)門配方：20 mM Tris/HCl，pH7.6,，100 mM  NaCl,，20 mM KCl，1.5 mM MgCl2,，0.5% NP-40 and protease inhibitors （0.5M PMSF）,。包用包好。

量不合適

很多時(shí)候,，CO-IP 沒有條帶,，是由于蛋白量，珠子,，抗體的量需要調(diào)整,。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，一般 100ug 蛋白,，3ug 抗體,，30ug 珠子,。如果不行,，250ug 蛋白，5ug 抗體,，或者 500ug 蛋白,，7ug 抗體,。

抗體太坑

抗體是 CO-IP 成敗的致命因素之一！必須是 IP 級別的抗體,。說句不好聽的話,，不要用國產(chǎn)抗體和 Santa Cruz 的抗體,。這些抗體在做 CO-IP 的實(shí)驗(yàn)室里面已經(jīng)臭名遠(yuǎn)揚(yáng)了?？尤藷o數(shù),。大家就不要再重蹈覆轍了。 

單抗與多抗的選擇也需要仔細(xì)考慮,。兩種抗體各有利弊,。單抗特異性強(qiáng)，背景低,。但是單抗有一個(gè)致命的弱點(diǎn),，就是識別位點(diǎn)單一，而在 CO-IP 過程中,，該位點(diǎn)很有可能與其它蛋白或核酸結(jié)合而被封閉,，導(dǎo)致單抗不能識別靶蛋白而沒有條帶。所以,，如果沒有十足把握,，單抗的識別位點(diǎn)遠(yuǎn)離靶蛋白與核酸結(jié)合的區(qū)域，還是選擇多抗比較穩(wěn)妥一些,。至少不會(huì)出現(xiàn)沒有條帶的問題,。

細(xì)胞數(shù)量太少 

很多時(shí)候,，CO-IP 沒有信號是由于細(xì)胞數(shù)量太少,。一般是 145 mm 的培養(yǎng)皿，至少要長到 50%以上,。如果低于這個(gè)數(shù)目,，CO-IP 就很有可能沒有信號。除非藥品和試劑非常非常昂貴,，否則就不要節(jié)約這點(diǎn)細(xì)胞了,。一旦 CO-IP 實(shí)驗(yàn)失敗，浪費(fèi)的時(shí)間可是更寶貴的,。

綜上所述,，CO-IP 是比較難做的一個(gè)實(shí)驗(yàn)。很多時(shí)候,，能否成功取決于抗體和兩個(gè)蛋白的結(jié)合常數(shù),，和 protocol 和實(shí)驗(yàn)操作本身的關(guān)系不大。以上,，介紹了一些經(jīng)驗(yàn)體會(huì)和小技巧小竅門,，希望對大家有所幫助。