CO-IP 并不容易做,，尤其是兩個蛋白豐度低,，相互作用力較弱的時候,。做 CO-IP 經常會遇到沒有條帶的問題,。這里談談 CO-IP 沒有條帶的常見原因和解決的辦法，更有獨門配方獻上,。

蛋白濃度過稀 

絕大多數情況下,，CO-IP 沒有條帶是由于蛋白濃度過稀。裂解產物的蛋白濃度越高越好,。但是,，有些實驗室喜歡稀釋裂解樣品的蛋白濃度再做 CO-IP。其實,，在大多數情況下要盡可能避免稀釋你的細胞裂解液,。盡量使細胞裂解產物的蛋白濃度可達 7-8 mg/ml 左右。這才會避免發(fā)生沒有條帶的情況,。

沒有裂解開 

很多時候,，由于裂解液不夠強烈，蛋白質復合物沒有分開,，也會造成沒有條帶的問題,。解決辦法是：加溫和加少量的 SDS 增加變性能力。這里再介紹一個小竅門：最初幾遍的漂洗 buffer 要和 IP 時的鹽濃度相同,。純化蛋白的時候,，如果用低鹽裂解細胞，高鹽漂洗去雜質,，蛋白丟失較多,。再奉獻一個獨門配方：20 mM Tris/HCl，pH7.6,，100 mM  NaCl,，20 mM KCl，1.5 mM MgCl2,，0.5% NP-40 and protease inhibitors （0.5M PMSF）,。包用包好。

量不合適

很多時候,，CO-IP 沒有條帶,，是由于蛋白量，珠子,，抗體的量需要調整,。根據經驗,，一般 100ug 蛋白，3ug 抗體,，30ug 珠子,。如果不行，250ug 蛋白,，5ug 抗體,，或者 500ug 蛋白，7ug 抗體,。

抗體太坑

抗體是 CO-IP 成敗的致命因素之一,！必須是 IP 級別的抗體。說句不好聽的話,，不要用國產抗體和 Santa Cruz 的抗體,。這些抗體在做 CO-IP 的實驗室里面已經臭名遠揚了?？尤藷o數,。大家就不要再重蹈覆轍了。 

單抗與多抗的選擇也需要仔細考慮,。兩種抗體各有利弊,。單抗特異性強，背景低,。但是單抗有一個致命的弱點,，就是識別位點單一，而在 CO-IP 過程中,，該位點很有可能與其它蛋白或核酸結合而被封閉,，導致單抗不能識別靶蛋白而沒有條帶。所以,，如果沒有十足把握,，單抗的識別位點遠離靶蛋白與核酸結合的區(qū)域，還是選擇多抗比較穩(wěn)妥一些,。至少不會出現沒有條帶的問題。

細胞數量太少 

很多時候,，CO-IP 沒有信號是由于細胞數量太少,。一般是 145 mm 的培養(yǎng)皿，至少要長到 50%以上,。如果低于這個數目,，CO-IP 就很有可能沒有信號。除非藥品和試劑非常非常昂貴,，否則就不要節(jié)約這點細胞了,。一旦 CO-IP 實驗失敗,，浪費的時間可是更寶貴的。

綜上所述,，CO-IP 是比較難做的一個實驗,。很多時候，能否成功取決于抗體和兩個蛋白的結合常數,，和 protocol 和實驗操作本身的關系不大,。以上，介紹了一些經驗體會和小技巧小竅門,，希望對大家有所幫助,。