今天我們談一談 RNA 抽提的問題。為了方便大家記憶,，總結(jié)出了“三大紀律八項注意",。

紀律一：無外源酶的污染。 

外源酶會造成 RNA 的降解,，造成 RNA 得率太低，或者*失敗,。而外源酶又是無處不在的,。這就要求注意以下三點：

注意一：嚴格戴好口罩，手套,。手指和呼吸時重要的外源酶的來源,。所以童鞋們做 RNA 抽 提的時候，還是要全副武裝起來,。這對自己也是一種保護措施,。 

注意二：實驗所涉及的離心管，槍頭,，移液器,，實驗臺面等要*處理。離心管和槍頭要用 DEPC 處理過,，單純的消毒滅菌可不行呀,。移液器和實驗臺面等要用 75%的酒精擦過。 

注意三：實驗所涉及的試劑/溶液,，尤其是水,，必須確保 RNase-Free。

紀律二：無內(nèi)源酶的活性,。 

這個和紀律一是一脈相承的,。目的都是減少 RNA 的降解，提高最終的得率,。而所有的組織都含有內(nèi)源酶,，這就要求我們在實驗過程中，千方百計滅活內(nèi)源酶,。這也就誕生了下面的四大注意事項： 

注意四：選擇合適的勻漿方法,。新鮮樣品取材后應(yīng)立即置于液氮中速凍，然后可以移至-70℃ 冰箱保存,。在碾磨前,，碾磨用具也必須預(yù)冷。在碾磨過程中,，一邊碾磨,，一邊補充液氮。樣品碾碎后，在液氮剛剛揮發(fā)完時,，將樣品迅速轉(zhuǎn)移到含裂解液的容器中,，立即混勻勻漿。

注意五：選擇合適的裂解液?，F(xiàn)在市場上常用的裂解液幾乎都能抑制 Rnase 活性,。但是，高內(nèi)源酶含量的樣品,，如肝臟,，脾臟等組織，建議使用含苯酚的裂解液,。苯酚的滅活內(nèi)源酶的能力是很強的,。 

注意六：控制好樣品的起始量。如果樣品的塊頭太大,，所有的細胞無法迅速和裂解液接觸,。里面沒有接觸到細胞的 RNA 很快就會被內(nèi)源酶降解。所以,，起始量不要太大,。如果塊頭太大，要把它切成小塊小塊的,。

紀律三：明確抽提目的,。 

我們做每一個實驗，甚至每一個步驟,，都要清楚這樣子做的目的是什么,。RNA 用于不同的實驗，其質(zhì)量的要求是不一樣的,。那么,，這就誕生了下面的最后兩條紀律： 

注意七：任何裂解液系統(tǒng)在接近樣品最大起始量時，抽提成功率急劇下降,。所以,，要進行樣品的破碎和勻漿。其目的是為了使 RNA *地完整地釋放出來,。如果樣品是細胞,，則無須破碎即可直接勻漿；如果是組織,，甚至器官,，那就需要破碎后才能勻漿；如果是酵母菌和細菌,，則需要先用相應(yīng)的酶破壁后才能勻漿,。

注意八：RNA 抽提成功的一個經(jīng)濟的標準是后續(xù)實驗的一次成功,，而不是得率。我們?yōu)槭裁匆樘?RNA,？是為了后面的實驗,，例如原位雜交，免疫沉淀等等,。所以,，一定要明確后面到底是要干嘛？cDNA 文庫構(gòu)建要求 RNA 完整而無酶反應(yīng)抑制物殘留,；Northern 對 RNA 完整性要求較高,，對酶反應(yīng)抑制物殘留要求較低；RT-PCR 對 RNA 完整性要求不太高,，但對酶 反應(yīng)抑制物殘留要求嚴格,。不用每次都以獲得最高純度的 RNA 為目的,，從而造成不必要的浪費,。

綜上所述，對大部分實驗者來說,，RNA 抽提比 DNA 抽提要困難得多,。所以，我們要個個牢記,，三大紀律八項注意,。