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果凍晶瑩剔透,,口感 QQ 的,,其實果凍的原料瓊脂糖,也是我們平時用來跑電泳的材料,,瓊脂糖凝膠電泳實驗常用以 DNA 切膠回收,,DNA 分離和用于佐證 DNA 是否重組、質粒等是否切開,。今天我們就來聊聊瓊脂糖凝膠電泳實驗的一些小技巧小細節(jié),。
第一步:膠液的制備
稱取 0.4g 瓊脂糖,置于 200ml 錐形瓶中,,加入 50ml 0.5×TBE 稀釋緩沖液,,放入微波爐里加熱,直到瓊脂糖全部熔化,,取出搖勻,,此為 0.8%瓊脂糖凝膠液??傄后w量不宜超過錐瓶的 50%容量,。否則會溢出來的。還要擦洗微波爐,。加熱過程中要不時搖動,,使附于瓶壁上的瓊脂糖顆粒進入溶液。加熱時應蓋上封口膜,,以減少水份蒸發(fā),。
第二步:膠板的制備
倒膠時的溫度不可太低,否則凝固不均勻,。東一塊西一塊的,。果凍做出來就不好看啦。速度也不可太快,否則容易出現(xiàn)氣泡,。果凍做出來里面都是氣泡,。怎么吃呀?待膠*凝固后撥出梳子,,注意不要損傷梳底部的凝膠,。
第三步:加樣
注意上樣時要小心操作,避免損壞凝膠或將樣品槽底部凝膠刺穿,。果凍下面被戳個窟窿,,還怎么吃呀?
第四步:電泳
加完樣后,,合上電泳槽蓋,,立即接通電源??刂齐妷罕3衷?60-80V,,電流在 40mA 以上。當溴酚藍條帶移動到距凝膠前沿約 2cm 時,,停止電泳,。
第五步:染色
未加 EB 的膠板在電泳完畢后移入 0.5μg/ml 的 EB 溶液中,室溫下染色 20-25 分鐘,。
第六步:觀察和拍照
在波長為 254nm 的長波長紫外燈下觀察染色后的或已加有 EB 的電泳膠板,。DNA 存在處顯示 出肉眼可辨的桔紅色熒光條帶。紫光燈下觀察時應戴上防護眼鏡或有機玻璃面罩,,以免損傷眼睛,。
除這些細節(jié)之外,還有一些注意事項:
1,、酶切時所加的 DNA 溶液體積不能太大,,否則 DNA 溶液中其他成分會干擾酶反應。
2,、酶活力通常用酶單位(U)表示,,酶單位的定義是:在最適反應條件下,1 小時*降解 1 mg λDNA 的酶量為一個單位,,但是許多實驗制備的 DNA 不象 λDNA 那樣易于降解,,需適當增加酶的使用量。反應液中加入過量的酶是不合適的,,除考慮成本外,,酶液中的微量雜質 可能干擾隨后的反應。
3,、市場銷售的酶一般濃度很大,,為了省著點兒花,,使用時可事先用酶反應緩沖液進行稀釋。 另外,,酶通常保存在 50%的甘油中,,實驗中,應將反應液中甘油濃度控制在 10%以下,,否則,,酶活性將受影響。
4,、觀察 DNA 離不開紫外透射儀,可是紫外光對 DNA 分子有切割作用,。從膠上回收 DNA 時,, 應盡量縮短光照時間并采用長波長紫外燈(300-360nm),以減少紫外光切割 DNA,。
5,、EB 是強誘變劑,還有中等毒性,,就是有致癌性,。配制和使用時都要戴好手套。盡量不要把 EB 灑到桌面或地面上,。如果真的不幸灑到桌面或地面上了,,凡是沾污了 EB 的容器或物品必須經(jīng)專門處理后才能清洗或丟棄。
6,、當 EB 放太多了,,膠染色過深,DNA 帶看不清的時候,,可將膠放入蒸餾水沖泡,,30 分鐘后再觀察。
以上,,安培君介紹了做果凍,,啊,不,!做瓊脂糖凝膠電泳實驗的一些小技巧小竅門,,也希望大家伙兒做出好吃的“果凍"來。
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