基因克隆在發(fā)明后的 32 年,，需求一直不斷增加,，但是有些小伙伴的重組質(zhì)粒就是怎么樣都構(gòu)建不出來。其實,，看似簡單的傳統(tǒng)基因克隆,，可是存在著重重陷阱！美國羅林斯研究中心 （Rollins Research Center）Ichiro Matsumura 在一期的《BioTechniques》上分享了他的經(jīng)驗： “Why Johnny can’t clone: Common pitfalls and not so common solutions."小編今天就把核心的 “姿勢"給大家提煉出來,，主要是瓊脂糖凝膠電泳,、酶（DNA 聚合酶、限制性內(nèi)切酶,、T4 連接 酶等）和試劑的使用等一些注意事項,。

▲從 PCR 產(chǎn)物到質(zhì)粒的工作流程

1.聚合酶 

DNA 聚合酶有兩個對 PCR 過程不可少的附加屬性,，但是不利于后續(xù)克隆的步驟。第一,， Taq/DNA 混合物的解離常數(shù)在室溫中是 20 nM,，與擴增產(chǎn)物的終濃度相當，因此酶往往與擴增產(chǎn)物同時純化,。實際上,，大多數(shù)其他商用 DNA 聚合酶與 DNA 結(jié)合的更加緊密。殘存的聚合酶可以阻止限制性內(nèi)切酶作用于 DNA 末端,，或者填補突出的部分,。第二，市場上一些改造后的新型 DNA 聚合酶相比于 Taq 酶熱穩(wěn)定性更高,，在有機溶劑和離液鹽中的構(gòu)象穩(wěn)定性也更高,，PCR 產(chǎn)物的純化更加困難了。

2.割膠回收 

載體經(jīng)過酶切后,，需要經(jīng)過凝膠純化提高克隆效率,。割膠回收對技術(shù)要求高，也很難自動化,， 而且 DNA 暴露在紫外光下會大大降低轉(zhuǎn)化效率,。凝膠純化的產(chǎn)量往往有限，因此研究人員需要消化毫克級的 DNA,，才能產(chǎn)生最后的終產(chǎn)物。殘留的瓊脂糖或凝膠提取過程中引入的各種溶劑和鹽,，可能抑制后續(xù) T4 連接酶的活性,，從而降低克隆效率。另外回收效率還與片段的長短相關(guān)，小于 500bp,，或者大于 4kb 的片段,，加異丙醇有助于提高回收效率。

3.限制性內(nèi)切酶 

限制性內(nèi)切酶的出現(xiàn)是為了保護細菌免受噬菌體及其他入侵者,。因此,，限制性內(nèi)切酶/DNA 底物的 KM 值相當?shù)停资铣?shù) KM 值等于酶促反應(yīng)速度為最大速度一半時的底物濃度，是酶的特征性常數(shù)之一,。KM 值只與酶的結(jié)構(gòu),、酶所催化的底物和反應(yīng)環(huán)境如溫度、PH,、 離子強度有關(guān),，與酶的濃度無關(guān)。Km 值愈小,，酶與底物的親和力愈大）,。所以“提高酶切反 應(yīng)中 DNA 的濃度，這樣凝膠純化的產(chǎn)物才足夠連接反應(yīng)使用"是錯誤的,！在這種情況下,， 限制性內(nèi)切酶會受到抑制，從而導(dǎo)致不*的消化,。

4.T4 連接酶 

連接反應(yīng)失敗的原因有很多,，但失敗可能在加入 T4 DNA 連接酶之前就發(fā)生了：由于 DNA 聚合酶擴增不*導(dǎo)致的末端不均一、酶切不*,、連接酶抑制劑或者突出的部分被補平,。在某些情況下，連接反應(yīng)失敗可能是因為退火效率不夠,、反應(yīng)緩沖液中的 ATP 濃度過低（室溫孵育時間過長）或者酶可能變性了,。T4 連接酶在室溫下相當穩(wěn)定，但如果被水而不是合適的 buffer 稀釋后可不是如此,。如果有問題,，可以通過陽性對照來檢測酶的完整性：

5.感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化 

在克隆過程中,，具有高效轉(zhuǎn)化效率的感受態(tài)細胞至關(guān)重要，這對于之前并不高的分子克隆效率具有一定的補償作用,。最常見的兩種轉(zhuǎn)化方法：熱激轉(zhuǎn)化和電穿孔,。電穿孔是*的，更重要的是,，轉(zhuǎn)化細胞的數(shù)量與 DNA 的量成正比,，可以達到微克級別,，且不會出現(xiàn)熱激中 出現(xiàn)的菌株效應(yīng)或者對質(zhì)粒的長度有限制，所以對于困難的克隆項目,，電穿孔無疑是首先選擇的方法,。不過雖然熱激轉(zhuǎn)化效率不及電穿孔，而且會因 DNA 過量（>10ng/200μl 感受態(tài)細胞）而抑制轉(zhuǎn)化,，但是它方便?。　氨槐?、熱一熱,、涼一涼、加一下再搖一搖"就搞定了,，所以還是有很多人使用這個方法的,！