基因克隆在發(fā)明后的 32 年,，需求一直不斷增加,，但是有些小伙伴的重組質(zhì)粒就是怎么樣都構(gòu)建不出來,。其實(shí)，看似簡單的傳統(tǒng)基因克隆,，可是存在著重重陷阱,！美國羅林斯研究中心 （Rollins Research Center）Ichiro Matsumura 在一期的《BioTechniques》上分享了他的經(jīng)驗(yàn)： “Why Johnny can’t clone: Common pitfalls and not so common solutions."小編今天就把核心的 “姿勢(shì)"給大家提煉出來，主要是瓊脂糖凝膠電泳,、酶（DNA 聚合酶,、限制性內(nèi)切酶、T4 連接 酶等）和試劑的使用等一些注意事項(xiàng),。

▲從 PCR 產(chǎn)物到質(zhì)粒的工作流程

1.聚合酶 

DNA 聚合酶有兩個(gè)對(duì) PCR 過程不可少的附加屬性,，但是不利于后續(xù)克隆的步驟,。第一， Taq/DNA 混合物的解離常數(shù)在室溫中是 20 nM,，與擴(kuò)增產(chǎn)物的終濃度相當(dāng),，因此酶往往與擴(kuò)增產(chǎn)物同時(shí)純化。實(shí)際上,，大多數(shù)其他商用 DNA 聚合酶與 DNA 結(jié)合的更加緊密。殘存的聚合酶可以阻止限制性內(nèi)切酶作用于 DNA 末端,，或者填補(bǔ)突出的部分,。第二,，市場(chǎng)上一些改造后的新型 DNA 聚合酶相比于 Taq 酶熱穩(wěn)定性更高，在有機(jī)溶劑和離液鹽中的構(gòu)象穩(wěn)定性也更高,，PCR 產(chǎn)物的純化更加困難了,。

2.割膠回收 

載體經(jīng)過酶切后，需要經(jīng)過凝膠純化提高克隆效率,。割膠回收對(duì)技術(shù)要求高,，也很難自動(dòng)化， 而且 DNA 暴露在紫外光下會(huì)大大降低轉(zhuǎn)化效率,。凝膠純化的產(chǎn)量往往有限,，因此研究人員需要消化毫克級(jí)的 DNA，才能產(chǎn)生最后的終產(chǎn)物,。殘留的瓊脂糖或凝膠提取過程中引入的各種溶劑和鹽,，可能抑制后續(xù) T4 連接酶的活性，從而降低克隆效率,。另外回收效率還與片段的長短相關(guān),，小于 500bp，或者大于 4kb 的片段,，加異丙醇有助于提高回收效率,。

3.限制性內(nèi)切酶 

限制性內(nèi)切酶的出現(xiàn)是為了保護(hù)細(xì)菌免受噬菌體及其他入侵者。因此,，限制性內(nèi)切酶/DNA 底物的 KM 值相當(dāng)?shù)停资铣?shù) KM 值等于酶促反應(yīng)速度為最大速度一半時(shí)的底物濃度,，是酶的特征性常數(shù)之一。KM 值只與酶的結(jié)構(gòu),、酶所催化的底物和反應(yīng)環(huán)境如溫度,、PH、 離子強(qiáng)度有關(guān),，與酶的濃度無關(guān),。Km 值愈小，酶與底物的親和力愈大）,。所以“提高酶切反 應(yīng)中 DNA 的濃度,，這樣凝膠純化的產(chǎn)物才足夠連接反應(yīng)使用"是錯(cuò)誤的！在這種情況下,， 限制性內(nèi)切酶會(huì)受到抑制,，從而導(dǎo)致不*的消化。

4.T4 連接酶 

連接反應(yīng)失敗的原因有很多,，但失敗可能在加入 T4 DNA 連接酶之前就發(fā)生了：由于 DNA 聚合酶擴(kuò)增不*導(dǎo)致的末端不均一,、酶切不*、連接酶抑制劑或者突出的部分被補(bǔ)平。在某些情況下,，連接反應(yīng)失敗可能是因?yàn)橥嘶鹦什粔?、反?yīng)緩沖液中的 ATP 濃度過低（室溫孵育時(shí)間過長）或者酶可能變性了。T4 連接酶在室溫下相當(dāng)穩(wěn)定,，但如果被水而不是合適的 buffer 稀釋后可不是如此,。如果有問題，可以通過陽性對(duì)照來檢測(cè)酶的完整性：

5.感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化 

在克隆過程中，具有高效轉(zhuǎn)化效率的感受態(tài)細(xì)胞至關(guān)重要,，這對(duì)于之前并不高的分子克隆效率具有一定的補(bǔ)償作用,。最常見的兩種轉(zhuǎn)化方法：熱激轉(zhuǎn)化和電穿孔。電穿孔是*的,，更重要的是,，轉(zhuǎn)化細(xì)胞的數(shù)量與 DNA 的量成正比，可以達(dá)到微克級(jí)別,，且不會(huì)出現(xiàn)熱激中 出現(xiàn)的菌株效應(yīng)或者對(duì)質(zhì)粒的長度有限制,，所以對(duì)于困難的克隆項(xiàng)目，電穿孔無疑是首先選擇的方法,。不過雖然熱激轉(zhuǎn)化效率不及電穿孔,，而且會(huì)因 DNA 過量（>10ng/200μl 感受態(tài)細(xì)胞）而抑制轉(zhuǎn)化，但是它方便??！“冰一冰、熱一熱,、涼一涼,、加一下再搖一搖"就搞定了，所以還是有很多人使用這個(gè)方法的,！