原代培養(yǎng)
原理
將動(dòng)物機(jī)體的各種組織從機(jī)體中取出,，經(jīng)各種酶（常用胰蛋白酶）,、螯合劑（常用 EDTA）或機(jī)械方法處理,，分散成單細(xì)胞,，置合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng),，使細(xì)胞得以生存,、生長(zhǎng)和繁殖，這一過程稱原代培養(yǎng),。
儀器,、材料及試劑
儀器：培養(yǎng)箱（調(diào)整至 37℃），培養(yǎng)瓶,、青霉素瓶,、小玻璃漏斗、平皿,、吸管,、移液管,、紗布、手術(shù)器械,、血球計(jì)數(shù)板、離心機(jī),、水浴箱（37℃）
材料：動(dòng)物組織塊
試劑：1640 培養(yǎng)基（含 20%小牛血清或胎牛血清）,，0.25%胰酶,，Hank′s 液,，碘酒
初代消化培養(yǎng)法
1. 準(zhǔn)備：取各種已消毒的培養(yǎng)用品置于凈化臺(tái)面，紫外線消毒 20 分鐘,。開始工作前先洗手,、75%酒精擦拭手至肘部。
2. 布局：點(diǎn)燃酒精燈,，安裝吸管帽,。
3. 處理組織：把組織塊置于燒杯中，用 Hanks 液漂洗 2~3 次,，去除血污,；如懷疑組織可能污染，可先置于含有青鏈霉素的混合液中 30~60 分鐘,。
4. 剪切：用眼科剪把組織切成 2~3 毫米大小的塊,，以便于消化。加入比組織塊總量多30~50 倍的胰蛋白酶液,，然后一并倒入三角燒瓶中,，結(jié)扎瓶口或塞以膠塞。
5. 消化：或用恒溫水浴,，或置于 37℃溫箱消化均可,，消化中每隔 20 分鐘應(yīng)搖動(dòng)一次，如用電磁恒溫?cái)嚢杵飨?。消化時(shí)間依組織塊的大小和組織的硬度而定,。
6. 分離：在消化過程中見消化液發(fā)混濁時(shí)，可用吸管吸出少許消化液在鏡下觀察,，如組織已分散成細(xì)胞團(tuán)或單個(gè)細(xì)胞,，立即終止消化，隨即通過適宜不銹鋼篩,，濾掉尚未充分消化開的組織塊,。低速（500~1000 轉(zhuǎn)/分）離心消化液 5 分鐘，吸出上清,，加入適量含有血清的培養(yǎng)液,。
7. 計(jì)數(shù)：用計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，如細(xì)胞懸液細(xì)胞密度過大,，再補(bǔ)加培養(yǎng)液調(diào)整后,，分裝入培養(yǎng)瓶中,。對(duì)大多數(shù)細(xì)胞來說,，pH 要求在 7.2~7.4 范圍,，培養(yǎng)液呈微紅色，如顏色偏黃,，說明液體變酸,，可用NaHCO3 調(diào)整,。
8. 培養(yǎng)：置于 36.5℃溫箱培養(yǎng)，如用 CO2 溫箱培養(yǎng),，瓶口需用紗布棉塞或螺旋帽堵塞,，紗布塞易生霉菌，每次換液時(shí)需要換新塞,。
初代組織塊培養(yǎng)法
1. 剪切：把組織小塊置于小燒杯或青霉素小瓶中,，用 Hanks 液漂洗二三次以去掉表面血污，吸靜 Hanks 液,，用眼科剪反復(fù)剪切 1mm3 塊為止,。
2. 擺布：用彎頭吸管吸取若干小塊，置于培養(yǎng)瓶中,，用吸管彎頭把組織小塊擺布在培養(yǎng)瓶底部,，小塊相互距離以 0.5cm 為宜，每一 25ml 培養(yǎng)瓶底可擺布 20~30 塊,。
3. 輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶,，另瓶底向上，注意翻瓶時(shí)勿另組織小塊流動(dòng),，塞好瓶塞,，置 36.5℃溫箱培養(yǎng) 2 小時(shí)左右（勿超過 4 小時(shí)）,，使小塊微干涸,。
4. 培養(yǎng)：從微箱中取出培養(yǎng)瓶，開塞,，46 度斜持培養(yǎng)瓶,，箱瓶底腳部輕輕注入培養(yǎng)液少許,，然后緩緩再把培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)過來，讓培養(yǎng)液慢慢覆蓋附于瓶地上的組織小塊,。置溫箱中靜止培養(yǎng),。待細(xì)胞從組織塊游出數(shù)量增多后。再補(bǔ)加培養(yǎng)液,。
傳代培養(yǎng)法
原理
細(xì)胞在培養(yǎng)瓶長(zhǎng)成致密單層后,，已基本上飽和，為使細(xì)胞能繼續(xù)生長(zhǎng),，同時(shí)也將細(xì)胞數(shù)量擴(kuò)大,，就必須進(jìn)行傳代（再培養(yǎng)）。 傳代培養(yǎng)也是一種將細(xì)胞種保存下去的方法,。同時(shí)也是利用培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行各種實(shí)驗(yàn)的必經(jīng)過程,。懸浮型細(xì)胞直接分瓶就可以，而貼壁細(xì)胞需經(jīng)消化后才能分瓶,。
材料和試劑
1. 細(xì)胞：貼壁細(xì)胞株
2. 試劑：0.25％胰酶,、1640 培養(yǎng)基（含 10％小牛血清或胎牛血清）
3. 儀器和器材：倒置顯微鏡，培養(yǎng)箱,、培養(yǎng)瓶,、吸管、廢液缸等
操作步驟
1. 吸除培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)舊培養(yǎng)液,。
2. 向瓶?jī)?nèi)加入胰蛋白酶和 EDTA 混合液少許,，以能覆滿瓶底為限。
3. 置溫箱中 2~5 分鐘,，當(dāng)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)回縮,，細(xì)胞間隙增大后，立即終止消化,。
4. 吸除消化液,，向瓶?jī)?nèi)注入 Hanks 液數(shù)毫升，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)瓶,，把殘余消化液沖掉,。注意加 Hanks 液沖洗細(xì)胞時(shí)，動(dòng)作要輕,，以免把已松動(dòng)的細(xì)胞沖掉流失,，如用胰蛋白酶液?jiǎn)为?dú)消化，吸除胰蛋白酶液后,，可不用 Hanks 液沖洗,，直接加入培養(yǎng)液。
5. 用吸管吸取營(yíng)養(yǎng)液輕輕反復(fù)吹打瓶壁細(xì)胞，使之從瓶壁脫離形成細(xì)胞懸液,。
6. 計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后,，把細(xì)胞懸液分成等份分裝入數(shù)個(gè)培養(yǎng)瓶中，置溫箱中培養(yǎng),。
無菌操作注意事項(xiàng)
1. 操作前要洗手,，進(jìn)入超凈臺(tái)后手要用 75%酒精或 0.2%新潔爾滅擦試。試劑等瓶口也要擦試,。
2. 點(diǎn)燃酒精燈,，操作在火焰附近進(jìn)行，耐熱物品要經(jīng)常在火焰上燒灼,，金屬器械燒灼時(shí)間不能太長(zhǎng),，以免退火，并冷卻后才能夾取組織,，吸取過營(yíng)養(yǎng)液的用具不能再燒灼,，以免燒焦形成碳膜。
3. 操作動(dòng)作要準(zhǔn)確敏捷,，但又不能太快,，以防空氣流動(dòng)，增加污染機(jī)會(huì),。
4. 不能用手觸已消毒器皿的工作部分,，工作臺(tái)面上用品要布局合理。
5. 瓶子開口后要盡量保持 45℃斜位,。
6. 吸溶液的吸管等不能混用。
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