細胞外囊泡 (EV) 在過去十年中取得了快速發(fā)展，在其起源,、疾病相關(guān)性以及診斷和治療等方面已有諸多的發(fā)現(xiàn)與報道,。在這些研究領(lǐng)域中，對 EV 的全面表征至關(guān)重要,，需要涵蓋EV單顆粒及整體分析,，例如粒度，電位,，濃度,，粒徑分布，以及檢測與 EV 相關(guān)的特征蛋白,，例如 CD9,、CD63、CD81、Alix 和 TSG1012-5,。如果想對EV的表型進行更深入的分析,，則須利用Western blotting、ELISA 或單囊泡/整體免疫標記等方法進行EV表型分析,。
目前,，還沒有一種方法可以將單個囊泡上的蛋白質(zhì)檢測與整體粒度分布和濃度測量相結(jié)合。納米顆粒追蹤分析 (NTA) 是一種應用于表征 EV 粒度分布的技術(shù),。NTA 基于斯托克斯-愛因斯坦方程,，通過追蹤單個顆粒的布朗運動來確定單個 EV 和 EV 群體的尺寸。NTA 利用激光照射顆粒,，理論上可以實現(xiàn)熒光染料的特異性激發(fā)和檢測熒光標記的 EV (NTA-FL),。然而，目前只有少數(shù)研究對 NTA-FL 進行了嚴格的評估,，并且這些研究依賴于非典型 EV 蛋白靶標或非特異性標記的免疫標記,。
美國塔夫斯大學 (Tufts University) 的研究人員們報道了一種熒光免疫標記單個 EV 用于 NTA-FL 的優(yōu)化算法，使得基于NTA的單囊泡免疫標記和檢測與粒度分布和濃度分析更為精準,。該算法可以有效地提高NTA檢測結(jié)果可信度,，為更深入研究 EV 的功能和機制提供了強有力的工具。
在前期研究中,，研究人員們發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)的利用NTA進行EV亞型分析的熒光/散射光比對方法會出現(xiàn)數(shù)據(jù)偏離的情況,。通常情況，熒光 (FM) 曲線所圍繞的面積與散射光 (LSM) 曲線所圍繞成的面積的比值可以表示EV的純度,。但是這些研究人員們在分析過程中發(fā)現(xiàn),，在測試1，2,，4中（表1,，圖1），F(xiàn)M（藍線)與LSM（紅線）的比值大于100%,，表明EV純度大于100%,，這顯然是不合理的，這種測試結(jié)果表明：1. 熒光檢測過程中,，可能出現(xiàn)了大量的假信號,。
2. NTA 系統(tǒng)的技術(shù)限制導致 LSM 無法檢測到非常小的 EV 或折射率低的其他顆粒。散射光模式下EV檢測不全,，有部分EV數(shù)據(jù)沒有檢測到,，使得LSM面積偏小，從而導致比值大于100%,。
3. 研究人員還發(fā)現(xiàn),，F(xiàn)M模式在50 nm以下的區(qū)域還有明顯的信號峰出現(xiàn),，而對比LSM模式，其在50 nm以下信號基本衰減為0,，這可能也是造成比值大于100%的原因之一,。具體而言，這可能是游離的熒光分子沒有充分去除,，以及體系中游離的蛋白質(zhì)被熒光分子標記,，造成小尺寸分區(qū)中的熒光信號增強。
表1 不同樣本的熒光面積（FM）與散射光面積（LSM）比值圖1 不同樣本在FM模式及LSM模式下NTA測試結(jié)果
為了解決這種情況,，研究人員們提出了兩種評估方法：
第一種方法是傳統(tǒng)的計算方法,，即計算樣本中大于 50 nm的顆粒數(shù)量,，并比較 FM 和 LSM 中的顆粒數(shù)量,，得出 FM 與 LSM 之間的比例。（圖2b,，c）
第二種方法是優(yōu)化后的計算方法,，計算兩種方法得到的粒度分布曲線之間的重疊區(qū)域，并將該區(qū)域與 LSM 中大于 50 納米的顆?？倲?shù)量進行比較,，得出重疊區(qū)域比例。（圖2d）
在研究過程中,，研究人員著重強調(diào)了他們對顆粒粒徑選取的取舍,。為了更精確地分析 EV，研究人員將分析范圍縮小到 50-200 納米,。之所以選擇這個范圍,，是因為大多數(shù) EV 的尺寸都在這個范圍內(nèi)。此外,，LSM對小于 50 納米的顆粒檢測能力有限,，而大于 200 納米的顆粒則可能并非 EV。因此,，將分析范圍縮小到 50-200 納米可以有效地排除其他類型的顆粒,，提高分析結(jié)果的準確性。
圖2 基于NTA的免疫標記算法示意圖
基于這種優(yōu)化算法,，研究人員對上述6組樣本的數(shù)據(jù)進行分析,，數(shù)據(jù)結(jié)果表明EV純度都回落至小于100%。
表2 算法優(yōu)化后不同樣本的熒光面積 (FM) 與散射光面積 (LSM) 比值（SA）
上述算法利用量子點標記和 NTA-FL 技術(shù),，通過比較熒光模式 (FM) 和散射光模式 (LSM) 的結(jié)果,，可以有效識別和分析在單個囊泡層面的不同亞型的 EV，并提供更精確的粒度分布信息,。然而,，盡管NTA-FL技術(shù)和優(yōu)化算法可以有效提高EV亞型分析的準確性,，但也必須認識到NTA技術(shù)在底層原理上存在一些局限性。NTA在檢測非常小的EV或粒徑分布寬的樣本（尤其是EV樣本）時存在一定的困難,。因此,，雖然NTA-FL技術(shù)和優(yōu)化算法可以提高粒度分布和濃度分析的準確性，但NTA的技術(shù)瓶頸并未得到克服,，后續(xù)的算法優(yōu)化以及熒光標記方法能否在錯誤的基礎(chǔ)上得到正確的結(jié)果仍需謹慎對待,，以免過分依賴這一技術(shù)所得到的數(shù)據(jù)。NanoCoulter納米粒度儀采用庫爾特原理,，打破了光學原理的局限性,，可以精準分析每個過孔顆粒，實現(xiàn)真正意義上的單顆粒檢測,，對粒徑分布廣的多分散系樣本有更好的測量效果,。且不受樣本的折射率、吸光度等光學性質(zhì)影響,，數(shù)據(jù)不擬合,，最真實的反應樣本狀態(tài)。
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