免疫比濁法是目前非常主流的一種免疫檢測方法,，其基本原理為：抗原抗體在緩沖液中特異性結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物，使反應(yīng)液出現(xiàn)濁度,，透光率下降,。在一定的比例范圍內(nèi)，反應(yīng)液的濁度和抗原抗體的量呈線性相關(guān)關(guān)系,，從而得到樣液中抗原的含量,。
免疫比濁中抗體的載體主要是膠乳微球，常見的膠乳微球由苯乙烯及相應(yīng)功能單體通過乳液聚合法制得,，粒徑范圍為50nm至400nm的一種納米材料,。膠乳微球的粒徑會影響免疫比濁靈敏度大小、抗體投入量多少,、包被微球的抗體活性及微球本身穩(wěn)定性等,，因此精準(zhǔn)監(jiān)控膠乳微球的粒徑分布情況，團(tuán)聚,、分散等狀態(tài)也成為微球的生產(chǎn)包被工藝流程中的重難點,。
免疫比濁試劑的研發(fā)過程中，需要對裸露的膠乳微球進(jìn)行包被以及封閉操作,，而在微球包被,、封閉結(jié)束后，通常需要通過高速離心的方法去除多余的蛋白和封閉劑,，在離心之后又需要超聲使微球均勻懸浮在液體當(dāng)中,。令人頭疼的是，超聲不足,，微球不能充分分散,；超聲過度，可能造成抗體或封閉劑從微球表面脫落,，容易造成微球聚集、沉淀。
微球顆粒越大,、濃度越高吸光度也會增大,，所以經(jīng)常會用紫外分光光度法測量微球的吸光度來反應(yīng)微球樣本的團(tuán)聚或者濃度情況。筆者通過紫外分光光度法研究了150nm微球包被前后的變化情況,，檢測了包被前的裸露150nm微球的吸光度為0.68A,，包被后微球吸光度為1.11A，就說明包被后樣本團(tuán)聚嚴(yán)重,。超聲分散后,，檢測微球吸光度為0.60A，此時微球吸光度與裸微球的吸光度相近,，說明微球已超聲分散好,，可以用于后續(xù)實驗。
但發(fā)現(xiàn)后續(xù)實驗結(jié)果與預(yù)期有較大的偏差,。猜想雖然包被后超聲的微球吸光度與裸微球的吸光度相近,，但微球的狀態(tài)很可能不一樣，而紫外分光光度計無法檢測到這樣的細(xì)節(jié),，分辨率較低,。因此需要一款高精度的納米顆粒表征儀器，目前高精度的納米單顆粒表征方法有納米粒子示蹤（NTA）,、納米流式,、納米庫爾特粒度儀（Nanocoulter），但是前兩種方法都是光學(xué)方法,，易受樣本的光學(xué)性質(zhì)影響,。Nanocoulter運用RPS（電阻感應(yīng)脈沖）原理，RPS作為電學(xué)的檢測方法,，不存在大小顆?；ハ嘤绊懙默F(xiàn)象，是真正意義上的單顆粒檢測方法,，反映樣本最真實的粒徑分布,。而且不受樣本吸光度、折光率影響,，與樣本光學(xué)性質(zhì)無關(guān),，擁有非常高的分辨率，可以精確看到樣本團(tuán)聚等細(xì)微變化,。
筆者選用了Nanocoulter檢測微球包被過程中各步驟的顆粒濃度,。數(shù)據(jù)顯示150nm裸微球濃度為5.338E+11（Particles/mL），且粒徑集中在150nm處,，樣本中只有微量團(tuán)聚體,，微球的均一性很好；包被后的微球，樣本中的團(tuán)聚明顯增多,，與吸光度反映一致,；而包被微球超聲后，濃度為4.602E+11（Particles/mL）,，相比裸微球,，包被后超聲微球濃度明顯下降，樣本損失了13.8%,。而且超聲后的微球并沒有分散好,，樣本中還有10%左右的團(tuán)聚顆粒。
至此,，筆者確定先前引起吸光度降低的原因,，就是因為工藝過程中微球的損失導(dǎo)致。另外,，超聲后吸光度雖降低,，但微球中其實還是有部分團(tuán)聚體，這種情況是分光光度計無法準(zhǔn)確分析的,。甚至因為損失,，分光光度計還會在遇見團(tuán)聚體時給出“分散較好"的誤導(dǎo)信息！但實際上,，微球吸光度一致時,，微球的團(tuán)聚情況也可能不同。
總結(jié)
納米庫爾特粒度儀（電阻法RPS）在免疫比濁試劑生產(chǎn)研發(fā)中有明顯優(yōu)勢：
1. 粒徑測量媲美電鏡,，可以準(zhǔn)確展示微球的粒徑分布,，分析團(tuán)聚情況；
2. 精準(zhǔn)的濃度測量,，分析微球包被工藝當(dāng)中的損失及分散情況,；
3. 真正意義上的單顆粒檢測，展示樣本的原始面貌,。
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