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SNK6細胞（人NK/T細胞淋巴瘤細胞）

細胞接收

1. 凍存細胞

如果是干冰運輸?shù)膬龃婕毎盏胶笳埩⒓崔D(zhuǎn)入液氮儲存保存,，或直接進行細胞復蘇。

2. 活細胞

收到后用 75%的酒精對 T25 瓶外表面進行消毒，之后放在 5%CO2,、37℃的細胞培養(yǎng)箱靜置 2 h，靜置后取出細胞瓶在顯微鏡下觀察細胞貼壁情況和細胞匯合度,，分別在 100 X 和 40 X 下各拍 2 個不同視野的細胞拍照記錄,。如果匯合度達到 80%以上的傳代密度，可以進行傳 代操作，如果細胞匯合度沒有達 80%以上不夠傳代,，棄掉瓶內(nèi)培養(yǎng)基,，更換新鮮完培養(yǎng)基。(灌滿細胞培養(yǎng)基不能正常用來培養(yǎng)細胞)

細胞復蘇

1. 水浴鍋 37℃預熱,；

2. 適合該細胞系的完培養(yǎng)基預熱到 37℃,；

3. 在 15 mL 離心管中加入 6 mL 完培養(yǎng)基備用；

4. 從液氮中取出細胞,，在 37℃水浴中輕輕轉(zhuǎn)動凍存管,，直到凍存管內(nèi)僅剩余一小塊冰芯，使細胞在 2 min 內(nèi)迅速解凍（水不能沒過蓋子或用封口膜把凍存管口封上）,；

5. 將凍存管轉(zhuǎn)移到超凈工作臺內(nèi),；打開蓋子前，用 75％酒精擦拭凍存管外部,；

6. 用移液槍吸取細胞凍存懸液,，轉(zhuǎn)移至已預熱的完培養(yǎng)基的離心管內(nèi)；

7. 細胞懸液以500 g離心 5 min,；

8. 離心后,，檢查上清液是否清澈，有無完整的細胞沉淀,；在無菌條件下,，小心吸掉上清液，加入 1 mL 完培養(yǎng)基,，輕柔吹打細胞沉淀,，充分吹散、混勻,；

9. 將細胞接種到 1 個 T25 培養(yǎng)瓶或同等底面積的培養(yǎng)容器,，每瓶加入 4 mL 完培養(yǎng)基；

10. 搖勻細胞,，放入 37℃,、5％CO2 的培養(yǎng)箱中（培養(yǎng)環(huán)境取決于細胞和培養(yǎng)基類型）；

11. 復蘇次日,，觀察細胞狀態(tài),。

(1) 貼壁細胞若細胞貼壁情況良好，可以更換新鮮的完培養(yǎng)基,；若觀察到細胞呈圓亮形態(tài) 但不貼壁,，可以讓細胞繼續(xù)培養(yǎng) 24 h 后再進行換液操作。之后,，根據(jù)細胞的生長狀況,，每 2-3 天更換一次完培養(yǎng)基,，觀察細胞，生長至 80％以上的匯合度,，即需傳代,。若細胞生長較慢或匯合度較低時，可以減少換液次數(shù),。

(2) 懸浮細胞復蘇后盡量放在相對小一些的容器中,，使用含 20％血清的培養(yǎng)基復蘇。懸浮細胞若細胞狀態(tài)良好,，可以更換新鮮的完培養(yǎng)基,；若細胞狀態(tài)差且呈現(xiàn)灰度，可以繼續(xù) 培養(yǎng) 24 h 后再觀察細胞,。觀察發(fā)現(xiàn)有活細胞,，可進行換液操作，觀察細胞無明顯變化,，及時反饋本公司售后,。

細胞傳代

1. 貼壁細胞

(1) 將完培養(yǎng)基、PBS,、胰酶預熱至 37℃,；

(2) 從培養(yǎng)容器中吸棄上清；

(3) 從容器一側(cè)輕輕加入 PBS（T25 培養(yǎng)瓶加入約 2 mL）洗滌細胞 1 次,。注意動作輕柔,，清洗全面，避免攪動細胞層,，前后搖晃容器數(shù)次吸去 PBS（注：沖洗步驟可去除可能抑制

解離劑作用的少量血清、鈣和鎂）,；

(4) 加入胰酶（T25 培養(yǎng)瓶加入約 1 mL）,，搖晃均勻，保證充分接觸細胞表面,。放入培養(yǎng)箱消化,；

(5) 顯微鏡下觀察消化情況，約 70％～80％細胞收縮變圓后,，輕拍培養(yǎng)容器外壁,，使細胞脫離培養(yǎng)表面；

(6) 立即加入 2-3 倍胰酶體積的完培養(yǎng)基（T25 培養(yǎng)瓶加入約 3 mL）,，隨即輕搖培養(yǎng)容器,，使培養(yǎng)基和胰酶迅速混勻，終止消化,；

(7) 使用移液管吸取細胞懸液,，吹打培養(yǎng)容器底面數(shù)次，盡可能將細胞都吹打下來；注意：

吹打動作不可劇烈,，避免產(chǎn)生大量氣泡,，損傷和損失細胞。

(8) 收集的所有細胞懸液以 500 g 離心 5 min,；

(9) 離心后去除上清,。加入1 mL完培養(yǎng)基，輕柔吹打細胞沉淀,，充分吹散,、混勻；

(10) 將細胞按一定的比例傳代接種,，建議按照 1：2 進行傳代,，若細胞在兩天內(nèi)長滿可增加傳代比例，若細胞生長三四天還未長滿,，可適當縮小傳代比例,； 注意：請根據(jù)細胞實際生長情況調(diào)整傳代比例。

(11) 搖勻細胞,，放入 37℃,、5％CO2 的培養(yǎng)箱中（如果使用培養(yǎng)瓶，將其放入培養(yǎng)箱前應將瓶蓋旋松,，以便進行充分的氣體交換,，除非您使用的是通氣式培養(yǎng)瓶和透氣性瓶蓋）；

(12) 傳代次日,，觀察細胞狀態(tài),。若發(fā)現(xiàn)較多死細胞，進行換液操作,。之后,，每天根據(jù)細胞的生長情況更換完培養(yǎng)基，觀察細胞,，生長至 80％以上的匯合度,，即需傳代或凍存。

2. 懸浮細胞

(1) 將完培養(yǎng)基,、PBS,、胰酶預熱至 37℃；

(2) 使用移液管吸取細胞懸液,，吹打培養(yǎng)容器底面數(shù)次,，盡可能將細胞都吹打下來；注意：

吹打動作不可劇烈,，避免產(chǎn)生大量氣泡,，損傷和損失細胞,。

(3) 收集的所有細胞懸液以 500 g 離心 4 min；

(4) 離心后去除上清,。加入1 mL完培養(yǎng)基,，輕柔吹打細胞沉淀，充分吹散,、混勻,；

(5) 將細胞按一定的比例傳代接種，建議按照 1：2 進行傳代,，若細胞在兩天內(nèi)長滿可增加傳代比例,，若細胞生長三四天還未長滿，可適當縮小傳代比例,；

注意：請根據(jù)細胞實際生長情況調(diào)整傳代比例,。

(6) 搖勻細胞，放入 37℃,、5％CO2 的培養(yǎng)箱中（如果使用培養(yǎng)瓶,，將其放入培養(yǎng)箱前應將瓶

蓋旋松，以便進行充分的氣體交換,，除非您使用的是通氣式培養(yǎng)瓶和透氣性瓶蓋）,；

(7) 傳代次日，觀察細胞狀態(tài),。若發(fā)現(xiàn)較多死細胞,，進行換液操作。之后,，每天根據(jù)細胞的生長情況更換完培養(yǎng)基,，觀察細胞，生長至 80％以上的匯合度,，即需傳代或凍存,。

細胞凍存

1. 按細胞傳代的方法，收集細胞沉淀,，根據(jù)沉淀大小加入適量培養(yǎng)基重懸細胞。

2. 用移液管吹打混合均勻,，取 20 μL 進行細胞計數(shù),；

3. 500 g 室溫離心 5 min，離心后,，打開蓋子吸去上清,，用 1~2 mL 4℃預冷的凍存液重懸細胞，隨后

4. 加入凍存液調(diào)整至密度為 1x10⁶-1x10⁷ 個細胞/mL,；

5. 將細胞懸液按 1 mL/管平均分裝至凍存管中,，旋緊蓋子,，凍存管應提前貼好細胞名稱、細胞代次,、數(shù)量,、凍存日期；

6. 將凍存管放置于 4℃預冷的程序降溫盒中,，并在凍存結束的 15 分鐘之內(nèi)將程序降溫盒放置超低溫冰箱內(nèi),；

7. 過夜后，將凍存細胞轉(zhuǎn)移至液氮罐內(nèi)保存,。

! 注意事項

1. 收到常溫細胞后,，及時拍照記錄有無漏液/瓶身破損現(xiàn)象。

2. 用 75%酒精擦拭細胞培養(yǎng)瓶表面,，顯微鏡下觀察細胞狀態(tài),。先不要打開培養(yǎng)瓶蓋，將細胞置于細胞培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng) 2~4 小時,，以便穩(wěn)定細胞狀態(tài),。

3. 仔細閱讀細胞說明書，了解細胞相關信息,，如貼壁特性,、細胞形態(tài)、所用基礎培養(yǎng)基,、傳代比例,、換液頻率等。

4. 靜置完成后,，取出細胞培養(yǎng)瓶,，鏡檢、拍照,，記錄細胞狀態(tài)（所拍照片將作為后續(xù)服務依據(jù)）,；建議細胞傳代培養(yǎng)后，定期拍照,，記錄細胞生長狀態(tài),。

5. 若觀察到異常或?qū)毎幸蓡?，請及時跟我們聯(lián)系,；對于細胞培養(yǎng)操作及培養(yǎng)注意事項有疑問的，可跟我們的技術支持交流,。

SNK6細胞（人NK/T細胞淋巴瘤細胞）