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大鼠肺表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白A（SP-A）試劑盒（ELISA）

使用說明書

• 本試劑盒用于體外定量檢測血清,、血漿,、組織勻漿及相關(guān)液體樣本中大鼠肺表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白A（SP-A）的含量,。

• 有效期：6個月

• 保存條件：2-8℃

• 本試劑盒僅供科研使用,，不得用于臨床診斷

  實驗原理

  試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）,。往預(yù)先包被大鼠肺表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白A（SP-A）捕獲抗體的包被微孔中,，依次加入標本、標準品,、HRP標記的檢測抗體,，經(jīng)過溫育并洗滌。用底物TMB顯色,，TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色,，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的大鼠肺表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白A（SP-A）呈正相關(guān),。用酶標儀在450nm 波長下測定吸光度（OD 值）,，計算樣品濃度。

  樣本處理及要求

  1. 血清：將收集于血清分離管的全血標本在室溫放置2小時或4℃過夜,，然后1000×g離心20 分鐘,，取上清即可，或?qū)⑸锨逯糜?/span>-20℃或-80℃保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融,。
  2. 血漿：用EDTA或肝素作為抗凝劑采集標本，并將標本在采集后的30分鐘內(nèi)于2-8℃ 1000×g離心15分鐘,，取上清即可檢測,，或?qū)⑸锨逯糜?/span>-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融,。
  3.  組織勻漿：用預(yù)冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織,，去除殘留血液（勻漿中裂解的紅細胞會影響測量結(jié)果），稱重后將組織剪碎,。將剪碎的組織與對應(yīng)體積的PBS（一般按1:9的重量體積比,，比如1g的組織樣品對應(yīng)9mL的PBS，具體體積可根據(jù)實驗需要適當調(diào)整,，并做好記錄,。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑）加入玻璃勻漿器中，于冰上充分研磨,。為了進一步裂解組織細胞,，可以對勻漿液進行超聲破碎，或反復(fù)凍融,。最后將勻漿液于5000×g離心5~10分鐘,，取上清檢測,。

  4.  細胞培養(yǎng)物上清或其它生物標本：請1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測,，或?qū)⑸锨逯糜?/span>-20℃或-80℃保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

  注：標本溶血會影響最后檢測結(jié)果,，因此溶血標本不宜進行此項檢測,。

  需要而未提供的試劑和器材

1. 酶標儀（450nm）

2. 高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL,、20-200uL,、200-1000uL

3. 37℃恒溫箱

4. 蒸餾水或去離子水

   試劑盒組成

備注：

1.  標準品濃度依次為：200、100,、50,、25、12.5,、6.25 pg/mL

2.  經(jīng)過大量正常標本檢驗,，標本的正常濃度值均在試劑盒提供的檢測范圍內(nèi)，實驗過程中直接取50μL樣本上樣即可,。當有部分樣本值超過最大標準品濃度時,，可用樣本稀釋液將標本進行適當稀釋后再進行實驗。

注意事項

1. 嚴格按照規(guī)定的時間和溫度進行溫育以保證準確結(jié)果,。所有試劑都必須在使用前達到室溫20-25℃,。使用后立即冷藏保存試劑,。

2. 洗板不正確可以導(dǎo)致不準確的結(jié)果,。在加入底物前確保盡量吸干孔內(nèi)液體。溫育過程中不要讓微孔干燥掉,。

3. 消除板底殘留的液體和手指印,，否則影響OD值。

4. 底物顯色液應(yīng)呈無色或很淺的顏色,，已經(jīng)變藍的底物液不能使用,。

5. 避免試劑和標本的交叉污染以免造成錯誤結(jié)果。

6. 在儲存和溫育時避免強光直接照射,。

7. 平衡至室溫后再打開密封袋以防水滴凝聚在冷板條上,。

8. 任何反應(yīng)試劑不能接觸漂白溶劑或漂白溶劑所散發(fā)的強烈氣體。任何漂白成分都會破壞試劑盒中反應(yīng)試劑的生物活性,。

9. 不能使用過期產(chǎn)品,。

10. 如果可能傳播疾病，所有的樣品都應(yīng)管理好,，按照規(guī)定的程序處理樣品和檢測裝置,。

    試劑準備

    試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡后方可使用,。

    20×洗滌緩沖液的稀釋：蒸餾水按1：20稀釋，即1份20×洗滌緩沖液加19份蒸餾水,。

    操作步驟

11.  從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條,，剩余板條用自封袋密封放回4℃。

12.  設(shè)置標準品孔和樣本孔,，標準品孔各加不同濃度的標準品50μL,；

13.  樣本孔中加入待測樣本50μL；空白孔不加,。

14. 除空白孔外,，標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的檢測抗體100μL，用封板膜封住反應(yīng)孔,，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min,。

15.  棄去液體，吸水紙上拍干,，每孔加滿洗滌液（350μL）,，靜置1min，甩去洗滌液,，吸水紙上拍干,，如此重復(fù)洗板5次（也可用洗板機洗板）。

16.  每孔加入底物A,、B各50μL,，37℃避光孵育15min。

17.  每孔加入終止液50μL,，15min內(nèi),，在450nm波長處測定各孔的OD值。

    實驗結(jié)果計算

    以所測標準品的OD值為橫坐標,，標準品的濃度值為縱坐標,，在坐標紙上或用相關(guān)軟件繪制標準曲線，并得到直線回歸方程,，將樣品的OD值代入方程,，計算出樣品的濃度。

    試劑盒性能

18. 檢測范圍：6.25 pg/mL – 200 pg/mL,。

19. 靈敏度：zui低檢測濃度小于1.0 pg/mL,。

20. 特異性：不與其它可溶性結(jié)構(gòu)類似物交叉反應(yīng)。

21. 重復(fù)性：板內(nèi)變異系數(shù)小于10% ,，板間變異系數(shù)小于15% ,。

    大鼠肺表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白A（SP-A）試劑盒

    說明

    由于現(xiàn)有條件及科學(xué)技術(shù)水平尚不能對所有供貨商提供的所有原料進行全面的鑒定與分析，本產(chǎn)品可能存在一定的質(zhì)量技術(shù)風(fēng)險,。

22. 最終的實驗結(jié)果與試劑的有效性,、實驗者的相關(guān)操作以及當時的實驗環(huán)境密切相關(guān),，請務(wù)必準備充足的標本備份。

23. 不同批次的同一產(chǎn)品可能會有少許差別,，如：檢測限,、靈敏度以及顯色時間等，請依據(jù)試劑盒內(nèi)說明書進行實驗操作,，網(wǎng)站電子版說明書僅作參考,。

24. 只有全部使用本試劑盒配套試劑才能保證檢測效果，不能混用其他制造商的產(chǎn)品,。只有嚴格遵守本試劑盒的實驗說明才會得到最佳的檢測結(jié)果,。

25. 本公司只對試劑盒本身負責(zé)，不對因使用該試劑盒所造成的樣本消耗負責(zé),，請使用者使用前充分考慮到樣本的可能使用量,，預(yù)留充足的樣本。

26. 使用化學(xué)裂解液制備的組織勻漿或細胞提取液可能會由于某些化學(xué)物質(zhì)的引入導(dǎo)致ELISA實驗結(jié)果偏差,。

27. 若樣本為細胞培養(yǎng)上清,，因該類樣本干擾因素較多，如：細胞狀態(tài),、細胞數(shù)量,、采樣時間等，所以可能存在檢測不出的情況,。

28. 某些天然蛋白或重組蛋白,，包括原核及真核重組蛋白，可能因為與本產(chǎn)品所使用的檢測抗體及捕獲抗體不匹配,，而不被檢測出,。