本期細(xì)胞學(xué)堂為大家整理了大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離提取的方法,、注意事項(xiàng)及鑒定指標(biāo),，幫助您快速上手開(kāi)展實(shí)驗(yàn)。
分離提取步驟
骨髓取材
將大鼠斷頸處死后, 置于75%醫(yī)用酒精內(nèi)浸泡5~10 min,，消毒后將動(dòng)物轉(zhuǎn)運(yùn)至超凈工作臺(tái)內(nèi),。無(wú)菌分離雙側(cè)股骨和脛骨，用新的剪刀鑷子清除股骨脛骨周圍肌肉組織,；保持骨頭完整,，留取純凈骨頭，將組織轉(zhuǎn)移至新的含有PBS的培養(yǎng)皿內(nèi),，剪去骨干的兩端, 暴露骨髓腔,；取注射器，吸取培養(yǎng)基,，從骨頭一端插針,，沖洗骨髓（至骨頭發(fā)白透亮），反復(fù)吹打制成單細(xì)胞懸液,。
分離方法
BMSCs常見(jiàn)的分離方法有密度梯度離心法,、貼壁法以及免疫磁珠分選法，大家可以根據(jù)自己實(shí)驗(yàn)室條件來(lái)選擇合適的分離方法,。
1
密度梯度離心法
將裝有大鼠骨髓液的15 mL離心管,，1500 rpm離心5 min；棄上清,，用完-全培養(yǎng)基重懸沉淀,；將培養(yǎng)基重懸的細(xì)胞懸液緩慢滴加到Percoll分離液（用PBS稀釋）上方,，形成密度梯度分離液；2000~2500 rpm離心25 min,，吸取中間層的白色霧狀細(xì)胞層,，加入PBS清洗細(xì)胞，1800 rpm離心5 min,；棄上清,，保留細(xì)胞沉淀；用細(xì)胞完-全培養(yǎng)基重懸沉淀,，將細(xì)胞懸液按1×106/mL密度接種于T25瓶中,，于37℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng),。首-次2 d換液,，棄去未貼壁細(xì)胞, 此后每2~3 d換液一次；待細(xì)胞融合達(dá)80%后, 用胰酶消化1~2 min后傳代培養(yǎng),。
2
貼壁法
也稱全骨髓培養(yǎng)法或一步法,。將收集的骨髓懸液經(jīng)200目篩網(wǎng)過(guò)濾后,，用完-全培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸液,；培養(yǎng)48 h首-次換液，棄去未貼壁細(xì)胞,；此后每2~3 d換液一次,，觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)及融合程度，待細(xì)胞融合80%以上后開(kāi)始傳代培養(yǎng),。
3
流式細(xì)胞儀或免疫磁珠分選法
免疫磁珠法和流式細(xì)胞儀分選法通過(guò)識(shí)別細(xì)胞表面特異性抗原分離細(xì)胞,，可獲得純度較高的細(xì)胞，但對(duì)細(xì)胞的活性影響較大,，獲得的細(xì)胞量少,，需要特殊的儀器，實(shí)際應(yīng)用受限,。
注意事項(xiàng)
鑒定指標(biāo)
01
細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察
剛分離提純的原代細(xì)胞形態(tài)呈圓形，大小不一,，漂浮于培養(yǎng)液中（圖1）,。經(jīng)純化貼壁后可見(jiàn)，細(xì)胞呈成纖維樣緊密排列,，漩渦樣生長(zhǎng),，胞核大、清晰,、呈長(zhǎng)梭形,，細(xì)胞形態(tài)趨于統(tǒng)一（圖2），其形態(tài)符合BMSCs 的貼壁形態(tài),。
圖1 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞剛分離,，呈圓形
圖2 普諾賽實(shí)驗(yàn)室提純的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞
02
表面標(biāo)志物
目前使用較多的是CD90、CD29,、CD44等陽(yáng)性表達(dá)指標(biāo),。
普諾賽實(shí)驗(yàn)室提取的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞CD90表達(dá)
(空格分隔,最多3個(gè),單個(gè)標(biāo)簽最多10個(gè)字符)
會(huì)員.png)
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