細(xì)胞培養(yǎng)過程中,，我們通常會(huì)遇到各種各樣的問題，這些問題一般是多種因素造成的,，如細(xì)胞密度,、培養(yǎng)環(huán)境、操作方法等,。2023年,，普諾賽圍繞細(xì)胞培養(yǎng)問題，共舉辦了10場(chǎng)線上直播,，吸引了萬余人觀看,。直播期間，大家踴躍發(fā)言,，提出了日常實(shí)驗(yàn)中遇到的問題,。本期直播答疑篩選出部分問題做了詳細(xì)解答。
牙源性干細(xì)胞培養(yǎng)時(shí),，血清會(huì)誘導(dǎo)分化嗎,？
血清成份復(fù)雜，里面包含抑制分化的因子,，也包含促進(jìn)分化的因子,；間充質(zhì)干細(xì)胞一類成體干細(xì)胞大多可以用血清培養(yǎng),，單能干細(xì)胞，用血清不會(huì)分化,；胚胎干會(huì)細(xì)胞分化,。
血清的刺激分化主要與血清品質(zhì)相關(guān)，品質(zhì)高的可以維持干細(xì)胞增殖,，抑制分化,；品質(zhì)較低的如新生牛血清會(huì)誘導(dǎo)分化；與生產(chǎn)批次也有關(guān)系,，不同批次因子含量不一,，分化效果不一。
? 篩選品質(zhì)高的血清批次,；
? 添加抑制分化的因子,，如bFGF，EGF等,；
? 及時(shí)傳代,，控制密度，刺激增殖,，高密度會(huì)引起分化,；
? 及時(shí)換液，防止代謝累積,，刺激分化,；
? 控制培養(yǎng)基質(zhì)量如內(nèi)毒素、支原體,、pH等等,，控制環(huán)境穩(wěn)定。
LX2細(xì)胞培養(yǎng)有哪些需要注意的點(diǎn),？
細(xì)胞密度高的時(shí)候,，消化3~4 min 才能完-全消化下來，細(xì)胞高密度下生長速度快,，低密度下細(xì)胞增殖慢甚至死亡,，建議傳代比例控制在1:2~1:4，不要超過1:4,。
鏡下觀察,，已經(jīng)開始生長分化的細(xì)胞漂浮
很多是什么原因？
細(xì)胞分化了之后是不會(huì)再增殖的,。細(xì)胞分化實(shí)驗(yàn)前期,，細(xì)胞還能緩慢增殖，但隨著實(shí)驗(yàn)的進(jìn)展,，漂浮的細(xì)胞越來越多,，這時(shí)候要分不同的情況處理：
? 如果實(shí)驗(yàn)前,，細(xì)胞長得過滿，可能因?yàn)榻佑|抑制產(chǎn)生較多漂浮細(xì)胞,。這種情況下,，只要貼壁的細(xì)胞沒有受到影響，實(shí)驗(yàn)可以繼續(xù),；
? 另一種情況,，是實(shí)驗(yàn)開始時(shí)的密度合適，實(shí)驗(yàn)開始后,，貼壁的細(xì)胞慢慢脫落漂浮，這種情況是不正常的,，需要結(jié)合實(shí)驗(yàn)前細(xì)胞狀態(tài),、實(shí)驗(yàn)所用的誘導(dǎo)試劑對(duì)細(xì)胞的影響等多方面的因素去調(diào)整。
NK-92細(xì)胞有些臟,，怎么梯度離心呢,？
正常培養(yǎng)的細(xì)胞系是沒有梯度離心這個(gè)概念的，梯度離心通常是用于細(xì)胞提取時(shí),，多種細(xì)胞混合在一起的一種分離措施,。懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的過程中會(huì)始終伴隨著細(xì)胞的死亡，細(xì)胞死亡后裂解就會(huì)產(chǎn)生碎片,。這種可以通過低速離心（800 rpm,，3~5 min）去除一部分，但無法完-全去除,。
細(xì)胞的密度怎么判斷,？
懸浮細(xì)胞需要計(jì)數(shù)來判斷。貼壁細(xì)胞可以看不同視野下細(xì)胞的密度,，以大多數(shù)視野下的密度為準(zhǔn),。需要注意的是，不是所有細(xì)胞都會(huì)平鋪單層,，有些細(xì)胞可能會(huì)堆疊生長,，比如Hep G2。
THP-1細(xì)胞貼壁了,，是怎么回事呢,？
THP-1是一類單核細(xì)胞，可以在特定的情況下分化為M0型的巨噬細(xì)胞,，這時(shí)的細(xì)胞就是會(huì)貼壁的,。培養(yǎng)的過程中如果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞出現(xiàn)了貼壁的情況，傳代的時(shí)候可以只收集漂浮的細(xì)胞,。同時(shí)排查實(shí)驗(yàn)室的環(huán)境,、培養(yǎng)基,、血清等，看看有沒有什么特定的影響因素導(dǎo)致細(xì)胞貼壁,。
NK-92越養(yǎng)活力越低,，怎么辦？
細(xì)胞培養(yǎng)傳代次數(shù)多了,，會(huì)存在狀態(tài)越來越差的情況,。可以在細(xì)胞狀態(tài)好的時(shí)候,，一邊傳代,，一邊凍存。NK-92細(xì)胞有很強(qiáng)的IL-2依賴性,，培養(yǎng)時(shí)要注意避免過度吹打,，團(tuán)塊吹散的同時(shí)，細(xì)胞也容易受損,。培養(yǎng)過程中,，一方面需要注意及時(shí)添加IL-2，一方面也需要注意吹打次數(shù),，一般輕輕吹2~3下將大團(tuán)吹成小團(tuán)就可以了,。
貼壁細(xì)胞，會(huì)有一些亮晶晶像油一樣的東
西,，這是污染了嗎,？
需要結(jié)合具體的細(xì)胞及圖片具體分析。如果是一些有成脂能力的細(xì)胞,，不排除是細(xì)胞培養(yǎng)的過程中受到某種刺激分化形成了脂滴,。除此以外，還需要排除器皿本身的影響,。最后結(jié)合顯微鏡下的圖片及視頻進(jìn)行判斷,，看是否有明顯微生物的痕跡。如果上述方法都無法判斷,，必要時(shí),，可以收集細(xì)胞培養(yǎng)液置于37℃培養(yǎng)箱進(jìn)行空培養(yǎng)，觀察是否有明顯的微生物增殖,。
為什么復(fù)蘇后細(xì)胞就老化了,？
細(xì)胞復(fù)蘇后老化，可能是因?yàn)榧?xì)胞凍存前的狀態(tài)不佳,，以及凍存時(shí)的保存活性效果不好,，這些都會(huì)影響細(xì)胞狀態(tài)，其中凍存損傷影響比較常見。建議控制凍存前狀態(tài),、控制凍存過程及凍存液確保細(xì)胞活率,。
誘導(dǎo)成脂肪細(xì)胞，只看形態(tài)嗎,？需要其他
方法進(jìn)行鑒定嗎,？
一般誘導(dǎo)效果好，脂滴大,，相差顯微鏡白光可以觀察到油滴,，可能會(huì)存在誤判，建議使用標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法,，用油紅O染色方法鑒定,。
懸浮細(xì)胞怎么進(jìn)行脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染？
懸浮細(xì)胞通常是當(dāng)天按實(shí)驗(yàn)所需細(xì)胞量接種細(xì)胞,，后續(xù)配置轉(zhuǎn)染復(fù)合物,，將轉(zhuǎn)染復(fù)合物滴加到培養(yǎng)基中，根據(jù)摸索好的轉(zhuǎn)染時(shí)間,，收樣檢測(cè)。
DNA和siRNA共轉(zhuǎn)染如何操作,？
設(shè)置好分組,，空白對(duì)照、陰性對(duì)照,、陽性對(duì)照,、DNA、siRNA,、DNA和siRNA共轉(zhuǎn)染（用無血清培養(yǎng)基稀釋DNA和siRN及DNA,，無血清培養(yǎng)基稀釋轉(zhuǎn)染試劑），摸索適宜的濃度,、比例,、轉(zhuǎn)染時(shí)間。
懸浮細(xì)胞培養(yǎng),，易成團(tuán),，如何盡量減少成
團(tuán)？
大多數(shù)懸浮細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)都會(huì)聚團(tuán),，還有些懸浮細(xì)胞本身就是聚團(tuán)長的,，不聚團(tuán)說明細(xì)胞活性較差，如NK-92細(xì)胞,。培養(yǎng)本身是聚團(tuán)生長的懸浮細(xì)胞,，是不可以減少細(xì)胞團(tuán)的。如果是存在少數(shù)聚團(tuán)，大部分單顆懸浮的細(xì)胞,，可以將細(xì)胞進(jìn)行高密度培養(yǎng).一般密度在200萬/mL時(shí),，細(xì)胞大部分是單顆分散的。
NCI-929細(xì)胞復(fù)蘇后很難養(yǎng),，細(xì)胞不增殖,，
怎么辦？
這是一株對(duì)營養(yǎng)要求較高的懸浮細(xì)胞,，培養(yǎng)的時(shí)候需要添加β-巰基乙醇,。如果細(xì)胞剛復(fù)蘇就生長緩慢，可以先用臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞的活性,。如果是復(fù)蘇時(shí)生長狀態(tài)較好,，但傳代后生長緩慢，可能是培養(yǎng)基的營養(yǎng)不夠,，比如沒有加β-巰基乙醇等,。另外，細(xì)胞不增殖可能與接種時(shí)的密度太低有關(guān),。懸浮細(xì)胞培養(yǎng)是有密度要求的,，一般情況下密度控制在50-200萬/mL為佳，密度太低了,，細(xì)胞增殖緩慢,，密度太高了，細(xì)胞可能會(huì)慢慢裂解死亡,。
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