雞卵泡顆粒細(xì)胞分離,、培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)步驟：
A. 翅下靜脈注射2mL EDTA-2Na(W/V,，2%)溶液處死母雞，新潔爾滅消毒液浸泡消毒5min,，打開(kāi)腹腔,，剪取整個(gè)卵巢，小心剝離卵泡(以8-15g為最佳),，置于裝有PBS緩沖液的無(wú)菌培養(yǎng)皿中,；
B. 用加有雙抗的PBS緩沖液沖去血污，漂洗3次,；將漂洗干凈的卵泡移入裝有預(yù)冷PBS緩沖液的平皿中,，剝凈卵泡外膜、結(jié)締組織及血管網(wǎng),；
C. 用手術(shù)刀在卵泡表面劃一道1-2cm長(zhǎng)的切口(動(dòng)作要快),，釋放卵黃，用PBS緩沖液將剩余的卵黃液漂洗干凈,，剩下的卵泡膜即為：基膜和卵泡顆粒細(xì)胞層,；
D. 將漂洗干凈的卵泡膜盡量剪碎，置于15mL離心管中,，加4mL培養(yǎng)基,，用1mL移液槍反復(fù)吹打1min，自然沉降5min,，收集上清液備用,；
E. 向離心管內(nèi)加入4mL 0.2%Ⅱ型膠原酶，重懸沉淀,，置于37℃恒溫水浴鍋中消化30min,，每5min震蕩一次；
F. 消化結(jié)束,，加入4mL M199*培養(yǎng)基(含10%血清)終止消化,；用200目不銹鋼篩過(guò)濾，收集濾液,，1200rpm離心5min,；
G. 沉淀用M199洗2次，室溫離心,，1200rpm,，5min；棄上清,，加入M199*培養(yǎng)基(含5%FBS及1%雙抗)重懸后接種于6孔塑料培養(yǎng)皿,，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng),；12-24h后換液,，隨后每天觀察,，2-3天換液一次，待雞卵泡顆粒細(xì)胞生長(zhǎng)融合用于實(shí)驗(yàn),。
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