細(xì)胞凍存與細(xì)胞復(fù)蘇，是細(xì)胞培養(yǎng)過程中的常見工作,。
細(xì)胞凍存,，是指將細(xì)胞貯存在超低溫環(huán)境中，使細(xì)胞暫時(shí)“冬眠"的技術(shù),，在需要的時(shí)候再進(jìn)行復(fù)蘇。
細(xì)胞復(fù)蘇,，是把凍存在-80℃冰箱或液氮中的細(xì)胞快速解凍,，并使細(xì)胞重新恢復(fù)生長的技術(shù)。
本文將為大家介紹細(xì)胞凍存與復(fù)蘇的技術(shù)要點(diǎn)和操作步驟,。
細(xì)胞凍存篇
凍存原則
細(xì)胞凍存原則為“慢凍",，即讓細(xì)胞在緩慢降溫的條件下逐漸冷凍。
如果直接將細(xì)胞懸液放在超低溫下快速冷凍,，細(xì)胞會(huì)受到冷凍損傷而死亡,。在凍存液中添加的保護(hù)劑（如DMSO、甘油）和在凍存盒中添加的異丙醇,，都起到程序性降溫的作用,。
DMSO使用注意事項(xiàng)
DMSO能夠快速穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞中，延緩溫度下降速度,，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成,，從而起到保護(hù)細(xì)胞的作用。
需注意的是,，DMSO溶于培養(yǎng)基時(shí),，將釋放大量熱量，所以細(xì)胞凍存液需提前配制,，不能直接將DMSO加入含有細(xì)胞的培養(yǎng)基中,，避免燙傷細(xì)胞。
另外,，DMSO屬于致癌物質(zhì),，使用時(shí)應(yīng)戴好手套，規(guī)范操作,。
程序凍存液配方
程序凍存液成分一般由基礎(chǔ)培養(yǎng)基,、胎牛血清,、DMSO組成。血清比例為10%~90%,，DMSO比例為5%~10%,。根據(jù)普諾賽實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞培養(yǎng)經(jīng)驗(yàn)，推薦凍存液配比：55%基礎(chǔ)培養(yǎng)基＋40%胎牛血清＋5%DMSO,，難養(yǎng)細(xì)胞可用90%胎牛血清＋10%DMSO凍存,。
細(xì)胞凍存密度
細(xì)胞凍存和復(fù)蘇過程中，不可避免會(huì)損失部分細(xì)胞,，所以凍存的密度不能太低,。提高凍存密度有助于提升細(xì)胞復(fù)蘇存活率，推薦密度為100~300萬細(xì)胞/mL,。
凍存操作方法
方法一：使用程序凍存盒
使用程序降溫盒是最-常用的凍存方法,。市面上的降溫盒有些需要添加異丙醇，有些則不需要,。
降溫盒須恢復(fù)室溫后再使用,。
根據(jù)普諾賽實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞培養(yǎng)經(jīng)驗(yàn)，使用程序凍存盒凍存效果良好,，沒有凍存盒的同學(xué)可以參照下文方法二和方法三,。
操作步驟
步驟1：配制程序凍存液，放在室溫備用或放在4℃預(yù)冷
步驟2：離心收集對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞（貼壁細(xì)胞消化下來離心,，懸浮細(xì)胞直接離心,，轉(zhuǎn)速1200rpm或250g，時(shí)間3min）
步驟3：用配制好的凍存液重懸細(xì)胞,，按照1~1.5mL/管分裝到凍存管中,，擰緊管蓋，做好標(biāo)記
步驟4：凍存管放入凍存盒,，凍存盒放入-80℃冰箱過夜（24h）
步驟5：凍存管從凍存盒取出,，轉(zhuǎn)移至液氮長期保存
▲ 使用凍存盒操作示意圖
方法二：使用無血清非程序凍存液
無血清非程序凍存液是一種商品化的凍存液，無需自己配制,，無需降溫盒,，大大提升了便捷性。
但是,，并非所有細(xì)胞都適用于這種凍存液,，使用前必須做凍存測試，沒問題后再批量應(yīng)用,。
操作步驟
步驟1：從冰箱拿出無血清非程序凍存液,，待用
步驟2：離心收集對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞（貼壁細(xì)胞消化下來離心，懸浮細(xì)胞直接離心，轉(zhuǎn)速1200rpm或250g,，時(shí)間3min）
步驟3：棄上清,，加入適量無血清非程序凍存液，重懸細(xì)胞
步驟4：按照1~1.5mL/管的量分裝到凍存管中,，擰緊管蓋,，做好標(biāo)記
步驟5：將凍存管直接移入-80℃冰箱中，24h后轉(zhuǎn)移至液氮長期保存
▲ 使用無血清非程序凍存液操作示意圖
方法三：手動(dòng)梯度降溫
在沒有凍存盒或者非程序凍存液時(shí),，可以選擇手動(dòng)梯度降溫,。但手動(dòng)梯度降溫不適用于所有細(xì)胞，且效果不穩(wěn)定,，同樣需要先做凍存測試,。
操作步驟
步驟1：配制程序凍存液，放在室溫備用或放在4℃預(yù)冷
步驟2：離心收集對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞（貼壁細(xì)胞消化下來離心,，懸浮細(xì)胞直接離心,，轉(zhuǎn)速1200rpm或250g，時(shí)間3min）
步驟3：用配制好的凍存液重懸細(xì)胞,，按照1~1.5mL/管分裝到凍存管中,，擰緊管蓋，做好標(biāo)記
步驟4：凍存管按照【4℃（20min）→-20℃（30min）→-80℃（24h）→液氮】的順序放置
▲ 手動(dòng)梯度降溫操作示意圖
細(xì)胞復(fù)蘇篇
細(xì)胞復(fù)蘇講究“快融",，越快融化,，細(xì)胞所受損傷就越小,。細(xì)胞復(fù)蘇的操作不復(fù)雜,，但每一步都必須穩(wěn)扎穩(wěn)打，才能最大限度地提高復(fù)蘇存活率,。
細(xì)胞復(fù)蘇步驟
步驟1：水浴鍋預(yù)熱至37℃?zhèn)溆?/strong>
步驟2：準(zhǔn)備15mL離心管,，并向其中加入適量培養(yǎng)基待用
小貼士：離心管中加入2~9mL的培養(yǎng)基，比較難養(yǎng)的細(xì)胞,，可適量增加培養(yǎng)基,。
步驟3：將細(xì)胞凍存管從-80℃冰箱或液氮中取出，放入PE手套中,，迅速投入水浴鍋
小貼士：如果冰箱或液氮距離水浴鍋路途較遠(yuǎn)（步行超過1min）,，要把細(xì)胞先置于干冰上，再送至水浴鍋,。如果將細(xì)胞凍存管直接放在手上或口袋里,，可能導(dǎo)致溫度逐漸回升而產(chǎn)生冰晶損傷細(xì)胞。而將細(xì)胞凍存管裝在PE手套中,，是為了預(yù)防污染,。
步驟4：用力搖晃凍存管，使其在1分鐘內(nèi)融化
小貼士：這一步越快融化越好，最好能放計(jì)時(shí)器在旁邊,。如果1分鐘內(nèi)沒有融化,，可能是凍存液量偏多，或者搖晃力度不夠,。
步驟5：用紙巾擦拭水漬,，轉(zhuǎn)移至生物安全柜。用移液槍吸取細(xì)胞懸液,，緩慢滴加到步驟2中準(zhǔn)備好的離心管
小貼士：當(dāng)同時(shí)復(fù)蘇多管細(xì)胞時(shí),，注意不要弄混。
步驟6：1200rpm離心3分鐘
小貼士：離心是為了去除DMSO,，對(duì)于DMSO敏感的細(xì)胞,，必須離心；若復(fù)蘇的細(xì)胞對(duì)DMSO不敏感,，步驟6,、步驟7可以省略，直接將培養(yǎng)基補(bǔ)足至10mL,，接種至培養(yǎng)器皿中,，第二天換液。
步驟7：棄上清,，用新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,，接種至新的無菌培養(yǎng)器皿中
▲ 細(xì)胞復(fù)蘇操作示意圖
做完步驟7，細(xì)胞就復(fù)蘇好了,。復(fù)蘇的細(xì)胞需要一段時(shí)間恢復(fù)狀態(tài),，當(dāng)復(fù)蘇后的細(xì)胞密度低于80%時(shí)，48小時(shí)內(nèi)不要換液,，待細(xì)胞形態(tài),、生長速度等恢復(fù)正常，再進(jìn)行細(xì)胞傳代等操作,。（不要因?yàn)閺?fù)蘇后兩三天細(xì)胞狀態(tài)不好就丟棄,，應(yīng)耐心等待至少一周。）
當(dāng)然,，細(xì)胞復(fù)蘇后狀態(tài)很好的情況下,，可以提前開始后續(xù)的細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。
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