ABI7500熱蓋簡介：
本公司可以大量提供ABI7500/7300這PCR儀全新或維修熱蓋部件（Cover）超長保修，可安排工程師全國上門安裝及調(diào)試,，*,。
現(xiàn)貨供應(yīng)ABI 7500、ABI 7500 Fast熒光定量PCR儀,,美國進口翻新儀器,一年保修期,。
大量現(xiàn)貨低價供應(yīng)各種進口品牌的熒光定量PCR儀,。 
ABI7500熱蓋應(yīng)用：
一. 開 機
1. 確認電腦與主機的數(shù)據(jù)通訊線(灰色USB連線)連接正確。
2. 確認電腦處于外接電源供電狀態(tài),。
3. 啟動電腦,，以Administrator用戶名登錄，進入Windows2000操作系統(tǒng),。
4. 待桌面圖標(biāo)出現(xiàn)后,，打開7000主機的電源。
5. 待主機的電源指示燈點亮后,，啟動7000 SDS應(yīng)用軟件,。
在進行實驗之前，請先檢查樣品加熱模塊以確定它沒有受到熒光污染,，具體方法請按照第6節(jié)的“熒光污染的檢查與處理”流程進行,。
二. 實時定量的軟件運行
基因表達的絕對定量和相對定量研究、轉(zhuǎn)基因食品的檢測(GMO),、各種病原體的檢驗檢疫等各種定量應(yīng)用,；以CT值的大小作為樣品陰性、陽性判定依據(jù)的定性應(yīng)用,；以及SNP檢測,、等位基因鑒定實驗等的第一步PCR擴增，都是采用實時定量模式，按照以下步驟操作,。
1. 新建文件 菜單File → New,，Assay選擇Absolute Quantification (實時定量模式)，打開一個空白的96孔板文件,。

2. 探針設(shè)置 雙擊任意一個孔,，打開Well Inspector窗口。該窗口也可以從菜單View → Well Inspector打開,。
3. 使用軟件,，或者探針（Detector）沒有設(shè)置好，請點擊Add Detector按鈕,，打開Detector Manager窗口,。該窗口也可以從菜單Tools → Detector Manager打開。如果Detector列表中沒有合適的探針,，點擊按鈕File → New,，新建探針：設(shè)定探針的名稱(建議使用所研究基因符號，如GAPDH,、ACTIN等),、報告基團(FAM或者VIC)、淬滅基團(TaqMan探針選TAMRA,；MGB探針選None),、顏色等。設(shè)置完成后點擊OK,，該探針即出現(xiàn)在探針列表中,。重復(fù)此過程，設(shè)立其他的探針,。
4. 在Detector Manager窗口,，從探針列表中點擊選擇所需探針，按住Ctrl鍵可以選擇多個探針,，再點擊Add to Plate Document按鈕,。最后點擊Done關(guān)閉Detector Manager窗口。此時Well Inspector窗口仍然是打開的,。
5. 填樣品表 在96孔表中選定有樣品的一個或多個孔,，在Well Inspector頁面的Sample Name欄中填入樣品名稱；在探針列表的Use項下的方框中,，打鉤選擇要用的一個或多個探針,；在Task欄中選擇樣品類領(lǐng)：陰性對照選NTC；未知樣品選Unknown,；標(biāo)準(zhǔn)品選Standard,。對于Standard,，還要在Quantity欄中輸入DNA拷貝數(shù)。注 意：只有在這里輸入拷貝數(shù)后,，軟件才能自動生成標(biāo)準(zhǔn)曲線,。建議標(biāo)準(zhǔn)品的濃度在5點以上。建議每個樣品(包括標(biāo)準(zhǔn)品)都按照統(tǒng)計學(xué)要求作一定數(shù)量的復(fù)管,。
6. 參比熒光 如果使用的是ABI公司的定量PCR試劑,，如TaqMan Universal PCR Master Mix或者SYBR Green PCR Master Mix等，參比熒光(Passive Reference)選ROX,；如果使用的試劑中不含有參比熒光,，請選None。完成后點擊右上角的X按鈕,，關(guān)閉Well Inspector窗口,。
7. 循環(huán)參數(shù) 切換到Instrument頁面，設(shè)定及修改PCR熱循環(huán)程序：在ABI公司默認的程序中,，50 C°C 2 C 15°min是UNG酶起作用的步驟,，UNG酶可以預(yù)防其他PCR擴增的產(chǎn)物(其中以U代替T)對定量PCR的污染；95 C 1°10 min是定量PCR的循環(huán)步驟,。7000默認在最后一步，也就是60°min的作用是激活金牌Taq酶,，同時滅活UNG酶,；40個循環(huán)的95 C 1°sec和60 min復(fù)性和延伸時收集熒光信號。如果使用ABI公司的定量PCR試劑,，上述參數(shù)不需要調(diào)整,，直接運行PCR循環(huán)就可以了。在使用其他廠家試劑的情況下,，如果其中沒有UNG酶,，請刪除50°C 2 min步驟；如果使用的不是金牌Taq酶而是其他普通的Taq酶,，請刪除95°C 10 min步驟,。
8. 循環(huán)參數(shù)的修改方法 刪除：按住Shift鍵并在相應(yīng)的Stage或Step中點擊，該步驟被選中變黑,，按Del鍵即可刪該步驟或循環(huán),。插入：在需要插入?yún)?shù)的位置點擊，出現(xiàn)粗黑豎線后,，分別點擊Add Hold,、Add Cycle或Add Step按鈕添加保溫、循環(huán)或循環(huán)中的一個步驟,。修改溫度和時間：拖動鼠標(biāo),，選中需要修改的溫度或時間數(shù)字,，輸入新的數(shù)值即可。
9. 其他設(shè)置 反應(yīng)體積：定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體積是50 μL,；如果想修改的話,，建議大于25 μL。融解曲線試驗：在Dissociation Protocol選項左邊的方框中打鉤,，儀器即在定量PCR循環(huán)完成后繼續(xù)做融解曲線試驗,。如果是采用SYBR Green I染料方法進行定量研究，建議進行融解曲線試驗,，以判定PCR反應(yīng)特異與否,。單峰表示單一的PCR擴增產(chǎn)物，多峰表示PCR擴增有雜帶,。注 意：只有SYBR Green I染料方法才需要進行融解曲線試驗,，TaqMan探針和MGB探針法都不需要。9600 Emulation：選中此項,，即可使7000的升降溫速度減慢,，與9600和7700一樣，從而可以直接使用在9600,、7700型PCR儀上優(yōu)化好的循環(huán)條件,，而不需任何修改。
10. 啟動擴增 點Save按鈕保存文件設(shè)置,。確認96孔板或全部樣品管在主機內(nèi)放置妥當(dāng)后,，點擊Start按鈕，開始PCR循環(huán),。屏幕上動態(tài)顯示PCR進程和剩余時間,。
11. 監(jiān)控進程 切換到Results頁面的Amp Plot子頁面，可以實時顯示PCR曲線隨著循環(huán)增加而逐步增長的實際情況,。如果Detector選FAM或VIC,，只顯示對應(yīng)探針的變化情況；如果選All,，則同時顯示所有探針的反應(yīng)進程,。
12. 保存結(jié)果 程序結(jié)束后，點Disconnect按鈕,，然后File → Save保存實驗結(jié)果,。可以保存為.sds格式,，也可以保存為.sdt格式,，作為以后同類實驗的模板，節(jié)省軟件設(shè)置時間,。
三. 實時定量的數(shù)據(jù)分析
1. 數(shù)據(jù)分析 切換到Result頁面,，進入擴增曲線(Amplification Plot)子頁面,，查看軟件已經(jīng)自動分析好的實驗結(jié)果。注 意：此時的數(shù)據(jù)是軟件根據(jù)默認值（基線起點為3,，終點為15）得到的初步結(jié)果,，還需要根據(jù)本次實驗的具體情況，精細調(diào)節(jié)Baseline（基線）的起止點后,，重新分析,，以得到更精確的數(shù)據(jù)。
2. 基線的起點和終點確定原則 基線(Baseline)是指PCR開始時信號很低,、接近背景且比較平穩(wěn)的那個階段,。起點要避開開始幾個循環(huán)由于高溫導(dǎo)致的信號增高，設(shè)在信號已經(jīng)降到背景高度且能維持平穩(wěn)的地方,，一般在3到6個循環(huán)之間,；終點要避免覆蓋信號已經(jīng)開始有明顯增長的地方，一般在本組數(shù)據(jù)中最小的CT值前再3個循環(huán)處,。另外,，起點與終點之間最好能間隔8個循環(huán)以上，以滿足統(tǒng)計基線標(biāo)準(zhǔn)偏差的數(shù)學(xué)要求,。調(diào)整好起止點以后,，再點擊Analyze按鈕，軟件即自動計算新的閾值和CT值,，并更新實驗報告,。注 意：此時擴增曲線頁面上顯示的閾值數(shù)字并不更新，但是這不影響后臺數(shù)據(jù)運算的準(zhǔn)確,。
3. 線性圖譜 在默認的設(shè)置中，PCR擴增曲線圖譜的縱坐標(biāo)代表經(jīng)過ROX和空白校正后的相對熒光信號強度,，橫坐標(biāo)代表PCR循環(huán)次數(shù)（從1到40）,；縱坐標(biāo)以對數(shù)表示，橫坐標(biāo)以線性表示,。如果要看*線性的S形圖譜,，請雙擊縱坐標(biāo)軸線，打開坐標(biāo)設(shè)置窗口,，將縱坐標(biāo)改成線性形式,。
4. 原始數(shù)據(jù) 切換到Component子頁面，察看原始數(shù)據(jù),。正常的FAM信號強度,，基線時約為5000點，擴增完成達到約28000點,，中間呈S形增長,；TAMRA和ROX的信號開始時都比FAM的基線要稍低一點,，TAMRA信號到指數(shù)增長階段會降低，而ROX信號是水平穩(wěn)定的,，不隨PCR進程而改變,，因為ROX是以固定濃度加入到PCR試劑中的，它本身并不參與PCR擴增,。
5. 原始數(shù)據(jù) 切換到Spectra子頁面,，也可以察看原始數(shù)據(jù)。Spectra與Component這兩個頁面的區(qū)別是：Component顯示的是信號強度隨時間(即PCR循環(huán)次數(shù))的變化,，是縱向的,；而Spectra顯示的是每個PCR循環(huán)點上信號強度在不同波長上的分布，也就是在4個濾色片上的分布,，是橫向的,。
6. 標(biāo)準(zhǔn)曲線 切換到Standard Curve子頁面，察看標(biāo)準(zhǔn)曲線,。注 意：只有在Set up時輸入標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)后,，軟件才能自動生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。
7. 實驗報告 切換到Report子頁面,，察看實驗報告,。確認無誤后，保存結(jié)果,。也可以從File菜單中選擇Export,，再選擇數(shù)據(jù)類型，輸出各種類型的數(shù)據(jù),，包括CT值,、相對信號強度、原始數(shù)據(jù),、融解曲線數(shù)據(jù)和實驗結(jié)果等,。輸出的數(shù)據(jù)可以用Excel打開，并可在Excel中重新生成擴增曲線,、標(biāo)準(zhǔn)曲線等圖譜,。
四. 終點讀板的軟件運行
各種等位基因鑒定實驗，包括SNP檢測,、基因突變檢測等,，都包括兩個階段：1、PCR擴增,；2,、擴增后的熒光信號讀取（Post-read）和數(shù)據(jù)處理,。第一步既可以在9700,、9600等普通的PCR儀上進行,，也可以在7000、7900等定量PCR儀上進行,；第二步必須在定量PCR儀上進行,。以下只敘述第二步Post-Read和數(shù)據(jù)處理的操作方法。如果第一步也在定量PCR儀上進行,，請按第三節(jié)實時定量的實驗方法設(shè)置和運行軟件,；待PCR完成、數(shù)據(jù)保存好后,，再將同一塊板放在7000上,，按以下步驟操作。
1. 新建文件 菜單File → New,，Assay選擇Allelic Discrimination (終點讀板模式,，用于SNP分析等)，新建一個空白96孔板文件,。
2. 探針設(shè)置 雙擊任意一個孔,，打開Well Inspector窗口。該窗口也可以從菜單View → Well Inspector打開,。
3. 使用軟件,，或者Marker沒有設(shè)置好，先點擊Add Detector按鈕,，打開Detector Manager窗口,。該窗口也可以從菜單Tools → Detector Manager打開。如果Detector列表中沒有合適的探針,，F(xiàn)ile → New,，新建探針，設(shè)定探針的名稱(建議使用等位基因的名稱,，如Allele 1,、Allele 2等)、報告基團(FAM或者VIC),、淬滅基團(TaqMan探針選TAMRA；MGB探針選None),、顏色(任意)等,。設(shè)置完成后點擊OK，該探針即出現(xiàn)在探針列表中,。
4. 位點設(shè)置 Detector設(shè)置好后,，點擊Add Marker按鈕，打開Marker Manager窗口,。該窗口也可以從菜單Tools → Marker Manager打開,。如果在Marker列表中找不到合適的探針,，點Create Marker，取名(建議使用位點的名稱,，如D2S1356等),，OK，新位點的名字即出現(xiàn)在左邊的位點列表中,，選中位點,，在右邊的探針列表中打鉤選擇與該位點配套的探針，一般FAM,、VIC各一個組成一套,。
5. 選擇位點 Marker設(shè)置完成后，在左邊的位點列表中選中該Marker,，點擊Copy to Plate Document按鈕,，該Marker的信息即分成3行出現(xiàn)在Well Inspector窗口中。重復(fù)選好全部所需Marker,，再點擊Done關(guān)閉Marker Manager窗口,。注 意：定量PCR實驗只要求設(shè)置探針(Detector)即可，而SNP實驗既要設(shè)置探針(Detector),，還要設(shè)置位點(Marker),。如果沒有設(shè)置Marker，軟件將不能進行基因分型,。
6. 填樣品表 在96孔表中選定有同類樣品的一個或多個孔,，在Well Inspector頁面的Marker列表的Use項下的方框中打鉤，選擇要用的Marker,，然后在探針的Task欄選擇樣品類型：陰性對照選NTC,；未知樣品選Unknown。沒有Std,。
7. 參比熒光 如果用的是ABI公司的PCR試劑,，如TaqMan Universal PCR Master Mix with or without UNG，參比熒光(Passive Reference)選ROX,；如果所用試劑中不含ROX參比熒光,，請選None。
點擊右上角的X按鈕關(guān)閉Well Inspector窗口,。
8. 循環(huán)參數(shù) 切換到Instrument頁面,。PCR熱循環(huán)程序只有60°C一個步驟，不需要修改,。設(shè)置反應(yīng)體積,。SNP的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體積是50 μL。點Save按鈕保存文件設(shè)置。
9. 終點讀板 確認96孔板或全部樣品管在主機內(nèi)放置妥當(dāng)后,，點擊Post-read按鈕,，開始讀取數(shù)據(jù)，大約10秒完成,。
10. 保存結(jié)果 程序結(jié)束后點Disconnect按鈕,，然后File → Save保存實驗結(jié)果。
五. 終點讀板的數(shù)據(jù)分析
1. 數(shù)據(jù)分析 切換到Results頁面,，Allelic discrimination子頁面,，在Marker下拉菜單中選擇要查看其數(shù)據(jù)的Marker，在下面96孔板界面中按Excel方式選擇需要查看的樣品孔,，軟件即在中間的圖譜上顯示信號的分布情況,。選擇不同的Marker，顯示不同的信號,?？梢渣c擊放大或縮小工具調(diào)整圖譜的大小。
2. 信號分布 正常的信號應(yīng)該分為4組,，靠近原點處為NTC,；靠近X軸的是VIC信號，是純合子,，其正常信號強度范圍在2-8之間,；靠近Y軸的是FAM信號，是另一種純合子,，其正常信號強度范圍在4-16之間,；靠近對角線位置的樣品中既有FAM信號也有VIC信號，是雜合子,，強度為FAM和VIC各自的一半左右,。
3. 基因分型 點擊套索工具，然后通過鼠標(biāo)圈定NTC信號,，在Call下拉菜單中選NTC,，這些數(shù)據(jù)點即被分型為NTC并顯示相應(yīng)的顏色和圖標(biāo)；同樣分型FAM純合子,、VIC純合子和雜合子,。
4. 保存結(jié)果 切換到Report頁面看實驗報告。確認無誤后,，保存分析結(jié)果,。也可以從File菜單中選擇Export，再選擇數(shù)據(jù)類型,，輸出各種類型的數(shù)據(jù)。
六. 日常維護
1. 熒光污染的檢查與處理 新建一個空的96孔板，菜單Instrument → Calibrate打開ROI Inspector窗口,，將Exposure Time調(diào)到4096,，選定Filter B，點擊Snapshot按鈕（不要動下面兩個按鈕,，以免ROI設(shè)置出錯）,，此時可以看到排列整齊的96孔圖像。如果觀察到特別明亮的光斑,，則表明該孔存在熒光污染,。將光標(biāo)移動到單個孔的上方可在右側(cè)欄中的Pixel Intensity處讀出該孔的熒光信號值，超過500以上的需要清洗,。清洗時盡量使用較細且無硬物突出的干棉簽擦拭,；如果未能去除，可用去離子水清洗,；如污垢頑固,，可使用90%乙醇清洗，但要等乙醇*揮發(fā)干凈后方可蓋上熱蓋,，以免有機溶劑損傷熱蓋上的透鏡組,。
2. 檢測器光源的更換流程 關(guān)機冷卻約15分鐘后，打開儀器頂部蓋板,，擰松燈泡保護罩的螺釘,，取下保護罩，將燈泡拆下,，更換新的燈泡并插好連線,。注 意：備用的新燈泡必須保存在干燥環(huán)境中。