PriCells: 原代細胞核孔復(fù)合物的分離                                                           

試劑和器材： 
1. 肝素,；
2. 苯j(luò)ia基磺酰氟（PMSF）（溶于乙醇中配制成1mol/L儲存液）,；
3. 純化的核膜,；
4. 提取緩沖液（EB）：含1%（體積分?jǐn)?shù)）Triton X-100的10mmol/L Tris-HCl,，（pH7.4）,、0.1mmol/L苯j(luò)ia基磺酰氟,；
5. Tris緩沖液：2mmol/L Tris-HCl,、pH7.4，10mmol/L Tris-HCl,、pH7.4,；
6. 梯度溶液：0.25mol/L蔗糖溶液和1.5mol/L蔗糖溶液溶于10mmol/L Tris-HCl,，pH7.4；
7. 所有溶液須含0.1mmol/L苯j(luò)ia基磺酰氟,；
8. 梯度收集器,；
9. 高速離心機，配有固定角轉(zhuǎn)子和離心管,；
10. 超速離心機,，配有固定角和吊桶式轉(zhuǎn)子、離心管,；
11. 超聲發(fā)生器（探針型,，帶有定時器）；
12. 雙室梯度儀或者Gradient MasterTM,；

實驗方法：
1. 采用提取緩沖液,，4℃抽提原代細胞核膜30min；
2. 20000g離心30min,，松散地沉淀核孔復(fù)合物薄片,。用2mmol/L Tris-HCl、（pH7.4）小心重懸沉淀,，再次離心,；
3. 用10mmol/L的Tris-HCl（pH7.4）小體積重懸沉淀（如1ml），并在冰浴上超聲處理,。為防止樣品產(chǎn)熱,，超聲過程中重復(fù)短時間處理（如10s），中間間隔冷卻,；
4. 通過制備負染標(biāo)本,，如用20g/L鉬酸銨（pH7.0）或50g/L鉬酸銨-1g/L海藻糖（pH7.0）進行電鏡分析，及時監(jiān)測核膜的破裂以及核孔復(fù)合物的釋放,。如果必要的話,，繼續(xù)超聲處理；
5. 將樣品加于0.25—1.5mol/L蔗糖-10mmol/L Tris-HCl（pH7.4）線性密度梯度溶液上,，4℃、約60000g離心1—2h,；
6. 從蔗糖梯度溶液中部分收集,；
7. 采用負染電鏡檢測收集各成分內(nèi)容物，以確定核孔復(fù)合物沉淀在蔗糖梯度溶液中的位置,，并進行完整性分析,；
8. 對梯度成分進行SDS-PAGE，檢測蛋白分離情況,；