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PriCells: 原代細胞核基質(zhì)的制備
PriCells: 原代細胞核基質(zhì)的制備
試劑和器材:
1. 硫酸銨(含10mmol/L Tris-HCl,(pH7.4)及0.2mmol/L MgCl2的1mol/L與0.2mol/L硫酸銨溶液);
2. 氯化鎂(1mol/L儲存液),;
3. 苯j(luò)ia基磺酰氟(PMSF)(無水乙醇配制的1mol/L儲存液),;
4. 純化的細胞核保存于含0.25mol/L蔗糖、10mmol/L Tris-HCl,,(pH7.4),、5mmol/L MgCl2的溶液中;
5. DNA酶Ⅰ,;
6. Tris-HCl(1mol/L儲存液,,pH7.4);
7. 懸浮緩沖液(SB):5mmol/L MgCl2,、10mmol/L Tris-HCl,,pH7.4(含0.1mmol/L苯j(luò)ia基磺酰氟);
8. Triton X-100,;
9. 低速離心機,,配有固定角轉(zhuǎn)子和離心管;
實驗方法:
所有的試劑置于0—4℃,,并且所有操作均在0—4℃完成,。
1. 向核懸液中加入Triton X-100使其濃度達到1%(體積分數(shù)),孵育30min同時用移液器小心混勻,,以免產(chǎn)生氣泡,;
2. 1000g離心10min,棄去上清,。用懸浮緩沖液小體積重懸提取的核沉淀(如5ml),;
3. 用DNA酶Ⅰ(30U/mg DNA)消化細胞核30min;
4. 通過緩慢添加1mol/L硫酸銨溶液來增加鹽濃度,,使其最終離子強度達到0.6(0.2mol/L 硫酸銨),,加入0.2mol/L硫酸銨使體積達到40ml,然后孵育30min,;
5. 1000g離心15min沉淀核基質(zhì),,棄去上清;
6. 用懸浮緩沖液重懸沉淀,,用相差顯微鏡或薄片電鏡檢測獲得的產(chǎn)物,;