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PriCells: 正常關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的短期培養(yǎng)
PriCells: 正常關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的短期培養(yǎng)
實驗材料：
1. 軟骨細(xì)胞來源：動物材料可選用未成年兔的膝關(guān)節(jié),、雞胚胸軟骨,。人體材料可取自引產(chǎn)胎兒或成年人手術(shù)切除的軟骨標(biāo)本；
2. 清洗液：不含Ca2+和Mg2+的1×PBS,，添加100IU/ml青霉素,、100μg/ml鏈霉素，pH7.2,；
3. 消化液：0.2%膠原酶Ⅱ溶液,，用PBS液配制,，過濾除菌；
4. 培養(yǎng)液：RPMI1640或Ham F12,、DMEM培養(yǎng)基,，一般在培養(yǎng)液中加20%—30%的小牛血清；
5. 篩網(wǎng)：200目銅網(wǎng),；
實驗方法：
1. 用手術(shù)刀片從關(guān)節(jié)表面削下軟骨組織片,，收集在PBS中。反復(fù)清洗除去軟骨片表面的血液以及可能誤帶的滑膜組織,。新鮮軟骨呈乳白淺藍(lán)色,、半透明狀，略具彈性,；
2. 將軟骨片充分剪成1mm3以下的組織塊,，用PBS清洗2次；
3. 按組織塊與消化液的體積比例為1：10的量加入消化液,，置于37℃水浴中輕微振蕩消化5h以上,，直至軟骨組織塊基本消失、溶液變渾濁為止,?；虿捎梅蛛A段消化法。即每消化1h就過濾,、離心1次,，將分離后的軟骨細(xì)胞立即放入培養(yǎng)液中保存起來,，這樣反復(fù)進(jìn)行,，直至所有軟骨組織塊消化*；
4. 以1500r/min離心10min,。收集細(xì)胞,；
5. 加入PBS清洗細(xì)胞；
6. 在細(xì)胞團中加入培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液,，用200目銅網(wǎng)過濾,，收集濾液；
7. 計數(shù)細(xì)胞,，根據(jù)需要調(diào)節(jié)細(xì)胞密度,；
8. 以1×105—1×106個/ml的密度接種。置于37℃,、5%CO2,、飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2d換1次培養(yǎng)液,；
9. 細(xì)胞長滿瓶壁后,，即可傳代,。屆時，用PBS清洗培養(yǎng)物,，加入0.125%胰蛋白酶溶液,，37℃下消化。鏡下觀察可見大部分細(xì)胞間基質(zhì)溶解消失,。當(dāng)細(xì)胞變圓時,，小心傾出含酶液，加入培養(yǎng)液,，吹打分散細(xì)胞,；
10. 分瓶接種并培養(yǎng)；
PriCells提供：
1. 各種原代細(xì)胞特制基礎(chǔ)培養(yǎng)基,；
2. 各種原代細(xì)胞培養(yǎng)特制添加劑,；
3. 原代細(xì)胞分離試劑盒；
4. 原代細(xì)胞鑒定試劑盒,；
5. 原代細(xì)胞總蛋白質(zhì)抽提物,；
6. 原代細(xì)胞總RNA；
7. 原代細(xì)胞總DNA,；