5
當前位置：武漢原生原代生物醫(yī)藥科技有限公司>>技術(shù)文章>>PriCells: 正常視網(wǎng)膜色素上皮細胞原代培養(yǎng)
PriCells: 正常視網(wǎng)膜色素上皮細胞原代培養(yǎng)
PriCells:正常視網(wǎng)膜色素上皮細胞原代培養(yǎng)
實驗材料：
1. 材料來源：人眼,、兔眼或者豬眼等；
2. 清洗液：不含Ca2+和Mg2+的1×PBS,，添加100IU/ml青霉素,、100μg/ml鏈霉素，pH7.2,；
3. 特殊取材器械：眼球托與7-0尼龍線,。以滅菌的白色橡膠反口膠塞作為眼球托；
4. 消毒液：200IU/ml的慶大霉素生理鹽水,；
5. 消化液：0.01%EDTA-0.125%胰蛋白酶的混合消化液,；
6. 培養(yǎng)液：為含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液；
7. 培養(yǎng)器皿：培養(yǎng)瓶,、24孔培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿若干,；
實驗方法：
1. 摘取眼球，用200IU/ml的慶大霉素生理鹽水浸泡消毒5min,。沿鋸齒緣后2—3mm處環(huán)形剪開眼球前段,，去除角膜、晶狀體以及玻璃體,。分離去掉視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層,。將眼球后段制成眼杯；
2. 將眼杯置于眼球托（可以洗凈消毒過的鹽水瓶膠塞替代）上,，取持針器用7-0尼龍線在4個對稱方向上,，把眼杯縫合固定在眼球托的壁緣上；
3. 用毛細吸管輕輕從眼杯中吸出視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層,。以PBS液漂洗眼杯2次,，吸干；
4. 加入0.01%EDTA-0.125%胰蛋白酶的混合消化液，置于無菌的燒杯中,。于37℃恒溫箱中消化30min,；
5. 吸去消化液。用PBS液稍洗,。加入有血清培養(yǎng)液終止消化酶的作用,，并用毛細吸管輕輕吹打眼杯內(nèi)壁，以使視網(wǎng)膜色素上皮細胞脫落,；
6. 收集眼杯內(nèi)的細胞懸液,，離心（800r/min）8min；
7. 棄上清液,，將沉淀的視網(wǎng)膜色素上皮細胞重新用培養(yǎng)液懸浮,。計數(shù)；
8. 以8×104—10×104個/ml的密度接種于培養(yǎng)瓶中,；
9. 送人培養(yǎng)箱中,，按常規(guī)方法培養(yǎng)，每周換液2次,；
10. 也可直接用機械分離植塊法：用無齒鑷撕下視網(wǎng)膜色素上皮細胞層,，經(jīng)PBS漂洗后，將其剪成1.5mm×1.5mm大小的組織塊,，直接接種于24孔培養(yǎng)板進行培養(yǎng),；
PriCells提供：
1. 各種原代細胞特制基礎(chǔ)培養(yǎng)基；
2. 各種原代細胞培養(yǎng)特制添加劑,；
3. 原代細胞分離試劑盒,；
4. 原代細胞鑒定試劑盒；
5. 原代細胞總蛋白質(zhì)抽提物,；
6. 原代細胞總RNA,；
7. 原代細胞總DNA；