PriCells: 正常兔原代晶狀體上皮細(xì)胞培養(yǎng)方案

實(shí)驗(yàn)材料：

1. 正常兔晶狀體組織,；

2. 不含Ca2+和Mg2+的1×PBS，添加200000IU/L青霉素,、200mg/L鏈霉素,，pH7.2；

3. 注射器,；

4. 培養(yǎng)器具：培養(yǎng)瓶或皿（用多聚賴氨酸包被）,、眼科剪、鑷子等,；

培養(yǎng)方法：

1. 空氣注射處死大兔,，在無菌條件下清除鞏膜外肌肉及結(jié)締組織后將眼球浸入含雙抗的1×PBS（pH7.2）浸泡5min，移入超凈工作臺內(nèi),；

2. 用含雙抗的1×PBS（pH7.2）沖洗組織3遍,，在超凈臺中環(huán)形剪除角膜放射狀剪開并撕除虹膜,，充分暴露晶狀體赤道部，用眼科鑷盡量靠近赤道部撕下晶體前囊膜,，將前囊膜剪成1×1mm2大小的碎片,；

3. 取200μl的吸頭一只，在酒精燈上用火焰燒彎,。用槍頭吸取組織塊接種于培養(yǎng)瓶中,，每瓶20-25塊左右，每小塊間距0.5cm左右,；

4. 組織塊放置好后,，輕輕將培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)，讓瓶底朝上,，向瓶內(nèi)加入2ml左右的培養(yǎng)液,，蓋好瓶蓋，將培養(yǎng)瓶倒置在培養(yǎng)箱中,，干貼壁2-4h,；

5. 干貼壁完成后，將培養(yǎng)瓶慢慢翻轉(zhuǎn)平放,，繼續(xù)靜置培養(yǎng),；48h后換液，更換2-3ml即可,；

6. 貼塊貼壁培養(yǎng)4-7d后,，在鏡下觀察可見大量細(xì)胞爬出，用吸管將組織塊吹下,、去除,，繼續(xù)放置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中,；

7. PriCells-原代上皮細(xì)胞細(xì)胞特制基礎(chǔ)培養(yǎng)基,；

8. PriCells-原代上皮細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)特制添加劑；

9. PriCells-原代細(xì)胞分離試劑盒,；

10. PriCells-原代細(xì)胞鑒定試劑盒,；

注意事項(xiàng)：

1. 材料預(yù)處理時要注意小心，不要破壞晶狀體結(jié)構(gòu),，要注意晶狀體前后,，確保撕取的是前囊膜。

2. 將組織塊貼于培養(yǎng)瓶中后,，對于培養(yǎng)瓶的移動,，翻轉(zhuǎn)，加液等動作一定要輕柔，以免使組織塊浮起,。

3. 去除組織塊的時機(jī)要選擇好,，去除過早，細(xì)胞數(shù)量太少,，會使細(xì)胞生長速度變慢，去除時間太晚,，會使部分區(qū)域細(xì)胞生長過密,，導(dǎo)致細(xì)胞老化，影響細(xì)胞狀態(tài),。

4. 嚴(yán)格控制上皮細(xì)胞培養(yǎng)條件,。包括細(xì)胞培養(yǎng)用液（培養(yǎng)基，生長因子,，血清,，抗生素）的質(zhì)量，濃度,。

5. 關(guān)于培養(yǎng)瓶包被與否,，有文獻(xiàn)研究顯示包被與未包被之間沒有特別大的差異。 實(shí)驗(yàn)中,，可以酌情考慮是否包被,。

6. 傳代培養(yǎng)細(xì)胞接種量為5×104個（25 cm2培養(yǎng)瓶），細(xì)胞倍增時間為48小時,。細(xì)胞傳代培養(yǎng)最佳為3-5代,，5代后晶體上皮細(xì)胞明顯成纖維細(xì)胞化，呈梭形或條狀,，細(xì)胞大小不等,，細(xì)胞相互分離形成拉網(wǎng)現(xiàn)象，傳代消化時間會有所延長,。