黃曲霉毒素(Total Aflatoxins)M1免疫親和柱操作說(shuō)明書(shū)

【概要】

黃曲霉毒素（Aflatoxin）是黃曲霉,、寄生曲霉等真菌產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物,，被世界衛(wèi)生組織的癌癥研究機(jī)構(gòu)劃分為1類(lèi)致癌物,，同時(shí)又是一種毒性*的劇毒物質(zhì),，廣泛存在于各種食物中,。玉米,，花生，大米,，小麥等谷物及其副產(chǎn)品是黃曲霉毒素的主要來(lái)源,，同時(shí)飼料中的黃曲霉毒素B1經(jīng)過(guò)動(dòng)物代謝后產(chǎn)生的黃曲霉毒素M1仍然具有很強(qiáng)的毒性和致癌性,，也廣泛存在牛奶，血液,，組織等食品中,。黃曲霉毒素作為肝癌的三大誘因之一，也是胃癌,，腸癌等疾病的主要原因,，對(duì)人類(lèi)的健康構(gòu)成很大威脅。世界各國(guó)對(duì)食品,，飼料中的黃曲霉毒素都有嚴(yán)格的*,。2010年6月1日開(kāi)始施行的乳品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)乳和乳制品中黃曲霉毒素M1的檢測(cè)進(jìn)行了規(guī)定，主要使用的樣品前處理方法就是免疫親和柱凈化法,。

【適用范圍及性能】

   本公司真菌毒素免疫柱系列產(chǎn)品測(cè)試形式是一個(gè)高性能的免疫親和柱,，設(shè)計(jì)用于在進(jìn)行 HPLC（高效液相色譜法）、GC-MS（氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián) 用 儀）,、ELISA（酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定）之前清理（凈化）或 濃縮樣本,。

   用于定性、定量檢測(cè)牛奶,，奶粉,，發(fā)酵乳，干酪,，奶油等樣品中黃曲霉毒素M1的以及樣品前處理,。

柱容量：≥100ng

回收率：≥90%

【試驗(yàn)原理】

本產(chǎn)品的測(cè)定的基礎(chǔ)是抗原抗體反應(yīng)，黃曲霉毒素M1單克隆抗體連接在柱內(nèi)凝膠上,，樣品中的黃曲霉毒素M1經(jīng)過(guò)提取,、過(guò)濾、稀釋?zhuān)缓髮悠诽崛∫壕徛耐ㄟ^(guò)黃曲霉毒素M1免疫親和層析柱,，在免疫親和柱內(nèi),，毒素與抗體結(jié)合，之后洗滌免疫親和柱除去沒(méi)有被結(jié)合的其他物質(zhì),。用甲醇洗脫黃曲霉毒素M1,，然后注入到分析儀器中用于檢測(cè)。

【包裝組成】

黃曲霉毒素M1標(biāo)準(zhǔn)品（選配）

25支/盒,，3mL柱管/支

產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)1份

【需要而未提供的設(shè)備及試劑】

設(shè)備：

┅┅高速均質(zhì)器或組織勻漿機(jī)

┅┅粉碎機(jī)

┅┅200mL/50mL量筒

┅┅天平：感量0.1g

┅┅酸度計(jì)

┅┅分液漏斗

┅┅微量移液器：?jiǎn)蔚?100mL～1000mL

┅┅槽紋濾紙（折疊快速定性或定量濾紙）

┅┅50mL漏斗

┅┅旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀

┅┅一次性玻璃試管

┅┅泵流操作架（包括空氣泵,，不同容積的玻璃注射器等）

┅┅燒杯，容量瓶,，錐形瓶等

試劑：

┅┅甲醇（色譜級(jí)）

┅┅乙腈（色譜級(jí)）

┅┅石油醚

┅┅蒸餾水或去離子水

┅┅氫氧化鈉溶液（0.5mol/L）稱(chēng)取2g氫氧化鈉溶解于100mL水中

【樣本處理步驟】

（一）牛奶

┅┅將100mL牛奶水浴加熱至40 oC,；

┅┅4000r/min離心15min，收集50mL清澈液待用

（二）乳粉和粉狀嬰幼兒配方食品

┅┅稱(chēng)取10g奶粉樣品,，將100mL50 oC水多次少量加入,，攪拌,，使奶粉充分溶解

┅┅6000r/min離心15min，收集50mL清澈液待用

（三）發(fā)酵乳(包括固體狀,、半固體狀和帶果肉型)

┅┅稱(chēng)取60 g混勻的試樣,，用0.5 mol/L 的氫氧化鈉溶液在酸度計(jì)指示下調(diào)pH至7.4；

┅┅用高速均質(zhì)器在 9500 轉(zhuǎn)/分鐘下告訴勻漿5 min

┅┅水浴加熱至40 oC,；

┅┅4000r/min離心15min，收集50mL清澈液待用

（四）干酪

┅┅稱(chēng)取經(jīng)切細(xì),、過(guò)10目圓孔篩混勻的試樣5g置于50 mL離心管中,，加2 mL水和30 mL甲醇；

┅┅用高速均質(zhì)器在 9500r/分鐘下告訴勻漿5 min,；

┅┅超聲提取30 min,；

┅┅在6000r/分鐘下離心15 min，收集上清液并移入250 mL分液漏斗中,。

┅┅在分液漏斗中加入30 mL石油醚（4.3）,，振搖2 min；

┅┅待分層后,，將下層移于50 mL燒杯中,，棄去石油醚層。

┅┅重復(fù)用石油醚提取2次,；,。

┅┅將下層溶液移到100 mL圓底燒瓶中，減壓濃縮至約2 mL,；┅┅濃縮液倒入離心管中,，燒瓶用乙腈-水溶液(1+4) 5 mL分2次洗滌，洗滌液一并倒入50 mL離心管中,；

┅┅加水稀釋至約50 mL,，在6000 轉(zhuǎn)/分鐘下離心 5 min，上清液供凈化處理,。

（五）奶油

┅┅稱(chēng)取5g試樣,，置于50 mL燒杯中；

┅┅用20 mL石油醚將其溶解并移于250mL具塞錐形瓶中,。

┅┅加20 mL水和30 mL甲醇,，振蕩30 min后，將全部液體移于分液漏斗中,；

┅┅待分層后,，將下層溶液全部移到100 mL圓底燒瓶中，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中減壓濃縮至約5 mL,，加水稀釋至約50mL,，供凈化處理,。

【親和柱凈化步驟】

┅┅將免疫親和柱連接于50.0mL玻璃注射器下。準(zhǔn)確移取50.0mL清澈液注入玻璃注射器,；

┅┅將空氣壓力泵與玻璃注射器連接,，調(diào)節(jié)壓力使溶液以約2-3mL/min流速緩慢通過(guò)免疫親和柱，直至2~3mL空氣通過(guò)柱體,；

┅┅更換10ml玻璃注射器與親和柱連接,，在注射器中加入10ml水，調(diào)節(jié)壓力使水以約6mL/min流速清洗親和柱,。

┅┅準(zhǔn)確加入4mL色譜級(jí)乙腈洗脫,，流速為1 mL/min ~2mL/min，收集全部洗脫液于玻璃試管中,，供檢測(cè)用,。

【結(jié)果判定】

經(jīng)免疫親和柱凈化后，收集到的乙腈洗脫液可直接使用熒光計(jì)或者HPLC檢測(cè),，也可使用薄層色譜或者酶聯(lián)免疫試劑盒進(jìn)行檢測(cè),。收集到的4ml洗脫液中的黃曲霉毒素含量相當(dāng)于50ml牛奶樣品、發(fā)酵乳樣品或者5g奶粉樣品,、干酪樣品和奶油樣品中黃曲霉毒素M1的含量,。

如果HPLC檢測(cè)需要其它溶劑，可以將乙腈洗脫液氮?dú)獯蹈?，然后?fù)溶

【注意事項(xiàng)】

┅┅黃曲霉毒素危害極大,，應(yīng)戴手套操作。

┅┅使用過(guò)的玻璃容器及黃曲霉毒素溶液最好用5%濃度的次氯酸鈉溶液浸泡過(guò)夜,。

┅┅不要使用過(guò)了有效日期的免疫親和柱,。

【貯藏條件及保存期】

貯藏條件：親和柱2-8℃保存，不可凍存,。

保存期：該產(chǎn)品有效期為12個(gè)月,。